Genome-scale CRISPRi identifies an LKB1–PKA–SIK module controlling an ENTPD1-centred transcriptional programme in primary human CD4⁺ T cells

प्रतिरक्षा प्रणाली संक्रमण से लड़ने वाली कोशिकाओं और शांति बनाए रखने वाली कोशिकाओं के बीच एक नाजुक संतुलन पर निर्भर करती है। इन शांतिदूतों में रेगुलेटरी टी सेल्स (regulatory T cells) शामिल हैं, जो एक विशेष समूह है जो शरीर को अपने ही ऊतकों पर हमला करने से रोकता है। जब ये कोशिकाएं सही ढंग से कार्य करने में विफल रहती हैं, तो प्रतिरक्षा प्रणाली शरीर के विरुद्ध हो सकती है, जिससे क्रोनिक सूजन और संधिशोथ (rheumatoid arthritis) जैसी बीमारियां हो सकती हैं, जहाँ जोड़ सूज जाते हैं और दर्दनाक हो जाते हैं। इन शांतिदूत कोशिकाओं के लिए एक प्रमुख मार्कर CD39 नामक एक एंजाइम है, जो उनकी सतह पर स्थित होता है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को शांत करने में मदद करता है। संधिशोथ के रोगियों में, इस एंजाइम की मात्रा और इसे ले जाने वाली कोशिकाओं की संख्या अक्सर रोग की गंभीरता और मेथोट्रेक्सेटट (methotrexate) नामक एक सामान्य उपचार के प्रति रोगी की प्रतिक्रिया के साथ जुड़ी होती है। हालांकि, लंबे समय तक, वैज्ञानिक उन आंतरिक स्विचों को पूरी तरह से नहीं समझ पाए थे जो एक टी सेल को इस शांत करने वाले एंजाइम का उत्पादन करने के लिए निर्देशित करते हैं।

एक नए अध्ययन ने इन स्विचों को अभूतपूर्व सटीकता के साथ मैप किया है। शोधकर्ताओं ने मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं में हजारों जीनों को व्यवस्थित रूप से एक-एक करके बंद करने के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण का उपयोग किया, ताकि यह देखा जा सके कि कौन से जीन CD39 के उत्पादन को नियंत्रित करते हैं। इन आनुवंशिक परिवर्तनों के बाद कोशिकाओं का अवलोकन करके, उन्होंने एक विशिष्ट तीन-भाग वाली 'कमांड चेन' की पहचान की जो मास्टर रेगुलेटर के रूप में कार्य करती है। इस श्रृंखला में एक प्रोटीन शामिल है जो दूसरे प्रोटीन को सक्रिय करता है, जो बदले में तीसरे प्रोटीन द्वारा रोका जाता है। जब शोधकर्ताओं ने इस श्रृंखला को बाधित किया, तो कोशिकाओं ने इस शांत करने वाले एंजाइम का उत्पादन लगातार बढ़ाया। अध्ययन ने इस खोज का पीछा वास्तविक रोगियों तक किया, जिससे पता चला कि वही आनुवंशिक कार्यक्रम बदल जाता है जब संधिशोथ के रोगियों में उपचार शुरू किया जाता है। यह कार्य एक मौलिक जैविक तंत्र को सीधे इस बात से जोड़ता है कि रोगी का शरीर दवा के प्रति कैसे प्रतिक्रिया करता है, जो ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए उपचार को समझने और संभावित रूप से सुधारने का एक स्पष्ट मार्ग प्रदान करता है।

यह जांच मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के भीतर एक विशाल, व्यवस्थित खोज के साथ शुरू हुई। वैज्ञानिकों ने प्राथमिक CD4+ टी कोशिकाओं से शुरुआत की, जो एक प्रकार की श्वेत रक्त कोशिका है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के केंद्रीय समन्वयक के रूप में कार्य करती है। उन्होंने स्वस्थ दाताओं से इन कोशिकाओं को लिया और उन्हें तीन अलग-अलग स्थितियों में रखा: विश्राम अवस्था (resting), संक्षिप्त उत्तेजना (briefly stimulated), और पूर्ण सक्रियता (fully activated)। प्रत्येक अवस्था में, उन्होंने 11,526 विभिन्न जीनों को शांत करने के लिए जीनोम-स्केल स्क्रीनिंग पद्धति का उपयोग किया। यह तकनीक, जिसे CRISPR इंटरफेरेंस कहा जाता है, शोधकर्ताओं को कोशिका को नुकसान पहुंचाए बिना विशिष्ट जीनों को बंद करने की अनुमति देती है, जो प्रभावी रूप से यह पूछती है कि किसी विशेष निर्देश को हटाने पर कोशिका के व्यवहार में क्या परिवर्तन आता है। लक्ष्य सरल लेकिन कठिन था: उन जीनों को खोजना जिन्हें बंद करने पर कोशिका अधिक CD39 एंजाइम का उत्पादन करती है।

तकनीकी शोर को छानने और यह सुनिश्चित करने के बाद कि आनुवंशिक परिवर्तन प्रभावी थे, शोधकर्ताओं ने सात जीनों के एक छोटे समूह को पाया जिन्होंने तीनों सेल अवस्थाओं में लगातार CD39 में वृद्धि की। जबकि इन सात जीनों ने विभिन्न जैविक कार्यों को कवर किया, तीन जीन विशेष रूप से उभरे क्योंकि वे एक सुसंगत सिग्नलिंग पाथवे (signaling pathway) बनाते थे। ये तीन जीन STK11, PRKAR1A, और SIK3 हैं। कोशिका जीव विज्ञान की भाषा में, STK11 एक काइनेज (kinase) है जो अन्य एंजाइमों को सक्रिय करता है, PRKAR1A प्रोटीन काइनेज ए कॉम्प्लेक्स की एक नियामक उप-इकाई है, और SIK3 एक अन्य काइनेज है जो पहले दो के प्रति प्रतिक्रिया करता है। शोधकर्ताओं ने पाया कि ये तीनों अलग-थलग कार्य नहीं करते हैं; वे एक विशिष्ट अनुक्रम में मिलकर काम करते हैं। STK11, SIK3 को सक्रिय करता है, जबकि PRKAR1A एक ब्रेक के रूप में कार्य करता है जो सामान्यतः SIK3 को नियंत्रण में रखता है। जब शोधकर्ताओं ने इन तीनों जीनों को बंद किया, तो संतुलन बिगड़ गया, जिससे CD39 के उत्पादन और प्रतिरक्षा नियमन से जुड़े व्यापक सेट में उछाल आया।

यह पुष्टि करने के लिए कि यह केवल एक संयोग नहीं था, टीम ने कोशिकाओं के संपूर्ण आनुवंशिक प्रोफाइल का अध्ययन किया। उन्होंने पाया कि इन तीन जीनों को बंद करने से होने वाले परिवर्तन आपस में उल्लेखनीय रूप से समान थे और प्रारंभिक सूची के अन्य चार जीनों द्वारा किए गए परिवर्तनों से भिन्न थे। इन तीन जीनों ने सोलह अन्य जीनों के एक विशिष्ट सेट को प्रभावित किया जो टी सेल फंक्शन के लिए महत्वपूर्ण माने जाते हैं, जिनमें वे भी शामिल हैं जो कोशिकाओं के संचार और सूजन को नियंत्रित करने में मदद करते हैं। जब शोधकर्ताओं ने मानव जीनोम के प्रत्येक जीन को इस आधार पर रैंक किया कि इसने इस विशिष्ट सोलह जीनों के सेट को कितना प्रभावित किया, तो STK11, PRKAR1A, और SIK3 सबसे ऊपर दिखाई दिए। वे इस विशेष जैविक कार्यक्रम को नियंत्रित करने के लिए पूरे जीनोम के सबसे प्रभावशाली जीनों में से थे। इस उच्च रैंकिंग ने, और इस तथ्य के साथ कि वे एक ज्ञात जैव रासायनिक पथ (biochemical pathway) बनाते हैं, शोधकर्ताओं को विश्वास दिलाया कि उन्होंने वास्तविक 'अपस्ट्रीम कंट्रोलर्स' को खोज लिया है।

अध्ययन केवल प्रयोगशाला बेंच तक ही सीमित नहीं रहा; यह नैदानिक रूप से यह देखने के लिए वास्तविक रोगियों तक पहुँचा कि क्या यह तंत्र मायने रखता है। शोधकर्ताओं ने मेथोट्रेक्सेट ले रहे संधिशोथ के 85 रोगियों के रक्त के नमूनों का विश्लेषण किया। उन्होंने उपचार शुरू करने से पहले और चार सप्ताह के बाद रोगियों के रक्त में आनुवंशिक गतिविधि की तुलना की। उन्होंने पाया कि STK11-PRKAR1A-SIK3 पाथवे द्वारा नियंत्रित जीनों का विशिष्ट समूह इस दौरान महत्वपूर्ण रूप से बदल गया। ये परिवर्तन यादृच्छिक नहीं थे; वे प्रयोगशाला प्रयोगों में देखे गए पैटर्न का पालन करते थे। विशेष रूप से, CD39 और दो अन्य संबंधित जीनों के स्तरों में इस तरह से बदलाव आया जो प्रयोगशाला में इस पाथवे को बाधित करने के प्रभावों से मेल खाता था। यह सुझाव देता है कि दवा रोगियों के शरीर में इस विशिष्ट जैविक सर्किट को सक्रिय कर रही है।

पूरी तरह से आश्वस्त होने के लिए, टीम ने अपने निष्कर्षों का परीक्षण 28 रोगियों के दूसरे, स्वतंत्र समूह में किया। इस समूह में, उन्होंने पूरे रक्त मिश्रण के बजाय सीधे रक्त से छांटी गई CD4+ टी कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया। उन्होंने एक स्कोर मापा जो यह दर्शाता है कि रेगुलेटरी टी सेल प्रोग्राम कितनी अच्छी तरह कार्य कर रहा है। जैसे-जैसे इन रोगियों को उपचार मिला, यह स्कोर कम हो गया, जो यह संकेत देता कि कार्यक्रम को संशोधित (modulated) किया जा रहा है। यह परिणाम डेटा के विश्लेषण के विभिन्न तरीकों में भी सही पाया गया, जिससे पुष्टि हुई कि प्रयोगशाला में पहचाना गया पाथवे मानव रोगियों में सक्रिय और प्रतिक्रियाशील है। दो रोगी समूहों और प्रयोगशाला प्रयोगों के बीच की निरंतरता इस निष्कर्ष को मजबूत करती है कि यह आनुवंशिक मॉड्यूल प्रतिरक्षा प्रणाली के उपचार के प्रति प्रतिक्रिया करने का एक केंद्रीय हिस्सा है।

शोधकर्ताओं ने यह भी पता लगाया कि क्या होता है जब CD39 एंजाइम स्वयं कम हो जाता है। CD39 बनाने वाले जीन को बंद करके, उन्होंने 14 अन्य जीनों में परिवर्तन देखे। इससे पता चला कि CD39 केवल एक निष्क्रिय मार्कर नहीं है बल्कि एक बड़े नेटवर्क का सक्रिय हिस्सा है जो कोशिका के व्यवहार को प्रभावित करता है। इसके अलावा, उन्होंने CD39 जीन को नियंत्रित करने वाले आनुवंशिक स्विचों के भौतिक स्थान का मानचित्रण किया। उन्होंने पाया कि STK11-PRKAR1A-SIK3 पाथवे में शामिल प्रोटीन DNA के एक विशिष्ट क्षेत्र से बंधते हैं जो CD39 जीन से काफी दूर है, जो एक रिमोट कंट्रोल की तरह कार्य करता है जो जीन को चालू या बंद करता है। यह स्थानिक संबंध उस भौतिक तंत्र की पुष्टि करता है जिसके द्वारा यह पाथवे एंजाइम को नियंत्रित करता है।

इस कार्य के निहितार्थ केवल एक एंजाइम को समझने तक सीमित नहीं हैं। यह अध्ययन एक स्पष्ट, कारण-संबंधी घटनाओं की श्रृंखला की पहचान करता है जो एक विशिष्ट आनुवंशिक पथ को नैदानिक परिणाम से जोड़ती है। यह दिखाकर कि मेथोट्रेक्सेट जैसा ड्रग इस विशिष्ट मॉड्यूल के माध्यम से कार्य करता है, यह शोध भविष्य के उपचारों के लिए एक ठोस लक्ष्य प्रदान करता है। यदि वैज्ञानिक STK11-PRKAR1A-SIK3 पाथवे को हेरफेर करने का तरीका समझ लेते हैं, तो वे प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया को अधिक सटीक रूप से नियंत्रित कर सकते हैं। इससे संधिशोथ और अन्य ऑटोइम्यून स्थितियों के लिए बेहतर उपचार मिल सकता है, जहाँ लक्ष्य प्रतिरक्षा हमले और प्रतिरक्षा शांति के बीच संतुलन बहाल करना होता है। यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीनिंग को सावधानीपूर्वक नैदानिक अवलोकन के साथ जोड़कर, मानव स्वास्थ्य और रोग को नियंत्रित करने वाले छिपे हुए नियमों को उजागर करना संभव है।