A fusion protein strategy for high-yield production of DOPA- modified recombinant mussel adhesive protein Pvfp-5P
यह अध्ययन *Pichia pastoris* का उपयोग करके एक हरित और स्केलेबल फ्यूजन प्रोटीन रणनीति प्रस्तुत करता है ताकि DOPA-संशोधित मसल एडहेसिव प्रोटीन Pvfp-5P का उच्च-उपज उत्पादन प्राप्त किया जा सके, जो बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए उत्कृष्ट लचीलापन, बहुमुखी सतह आसंजन और बेहतर घाव भरने को बढ़ावा देने का प्रदर्शन करता है।
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महासागर की सतह से काफी नीचे, मसल्स (mussels) लहरों और ज्वार-भाटे की निरंतर मार को चुनौती देने वाली दृढ़ता के साथ चट्टानों, जहाजों के निचले हिस्सों और घाटों से चिपके रहते हैं। वे यह उपलब्धि बोतल में रखे गोंद से नहीं, बल्कि अपने पैरों से स्रावित एक विशेष प्रोटीन के माध्यम से प्राप्त करते हैं। यह प्राकृतिक चिपकने वाला पदार्थ, जिसे मसल एडहेसिव प्रोटीन (mussel adhesive protein) के रूप में जाना जाता है, में DOPA नामक एक अनूठा रासायनिक घटक होता है। यह अणु एक आणविक वेल्क्रो (molecular velcro) की तरह कार्य करता है, जो लगभग किसी भी सतह के साथ मजबूत बंधन बनाने में सक्षम है, चाहे वह गीली हो, सूखी हो, खुरदरी हो या चिकनी हो। इन गुणों के कारण, वैज्ञानिकों ने लंबे समय से इस प्रोटीन का उपयोग मानव चिकित्सा में करने की इच्छा जताई है, इस उम्मीद में कि बेहतर पट्टियाँ, सर्जिकल गोंद या चिकित्सा उपकरणों के लिए कोटिंग बनाई जा सके। हालाँकि, मसल्स से सीधे इस प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा एकत्र करना धीमा और अक्षम है, और प्रयोगशाला में इसे बनाने का प्रयास ऐतिहासिक रूप से कठिन रहा है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर उत्पाद की बहुत कम मात्रा प्राप्त होती है जिसमें उस महत्वपूर्ण रासायनिक संशोधन की कमी होती है जो इसे काम करने के योग्य बनाता है।
शोधकर्ताओं की एक टीम ने एक सूक्ष्म यीस्ट (yeast) Pichia pastoris की ओर मुड़कर इस उत्पादन समस्या को हल करने का प्रयास किया, जो जैव प्रौद्योगिकी में प्रोटीन के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए प्रसिद्ध एक कार्यवाहक है। चुनौती यह थी कि यीस्ट स्वाभाविक रूप से मसल प्रोटीन का अच्छी तरह से उत्पादन नहीं करता था, और इसमें आवश्यक DOPA संशोधन जोड़ने के लिए आंतरिक मशीनरी का अभाव था। इस पर काबू पाने के लिए, वैज्ञानिकों ने एक चतुर फ्यूजन रणनीति (fusion strategy) विकसित की। उन्होंने मसल प्रोटीन के जीन को लिया और उसे एक डीएनए के टुकड़े से जोड़ा जो एक कोलेजन जैसे फ्रैगमेंट (collagen-like fragment) को कोड करता है, जो प्रोटीन का एक प्रकार है जिसे यीस्ट प्रचुर मात्रा में पसंद करता है और उत्पन्न करता है। उन्होंने एक दूसरा जीन भी पेश किया जो एक मिट्टी के बैक्टीरिया (soil bacterium) से लिया गया था, जो एक फैक्ट्री वर्कर की तरह कार्य करता है ताकि प्रोटीन के टायरोसिन बिल्डिंग ब्लॉक्स को महत्वपूर्ण DOPA सामग्री में परिवर्तित किया जा सके। यह संयुक्त प्रणाली यीस्ट कोशिका के भीतर एक एकल, उच्च-उपज वाली उत्पादन लाइन के रूप में कार्य करने के लिए डिज़ाइन की गई थी।
इस दृष्टिकोण के परिणाम आश्चर्यजनक थे। जब शोधकर्ताओं ने इंजीनियर किए गए यीस्ट को मानक प्रयोगशाला फ्लास्क में उगाया, तो कोशिकाओं ने लगभग 300 मिलीग्राम प्रति लीटर की दर से नया फ्यूजन प्रोटीन स्रावित किया। यह पिछले प्रयासों की तुलना में एक महत्वपूर्ण छलांग है, जो अक्सर 100 मिलीग्राम प्रति लीटर तक भी उत्पादन करने में संघर्ष करते थे। टीम इस प्रोटीन को एक ही चरण में शुद्ध करने में सक्षम थी, जिससे अशुद्धियों को हटाकर 90 प्रतिशत से अधिक की शुद्धता स्तर प्राप्त हुआ। महत्वपूर्ण रूप से, रासायनिक विश्लेषण ने पुष्टि की कि प्रोटीन सफलतापूर्वक संशोधित किया गया था, जिसमें वजन के अनुसार 2.5 प्रतिशत DOPA मौजूद था। हालांकि यह प्राकृतिक रूप से प्राप्त मसल प्रोटीन में पाए जाने वाले 3.3 प्रतिशत से थोड़ा कम है, लेकिन यह चिकित्सा उपयोग के लिए प्रभावी माने जाने वाले दायरे के भीतर है और अन्य विधियों द्वारा उत्पादित बिना संशोधित संस्करणों की तुलना में बहुत बेहतर है।
यह परीक्षण करने के लिए कि क्या यह लैब-निर्मित प्रोटीन वास्तव में काम करता है, शोधकर्ताओं ने जांच की कि यह जीवित कोशिकाओं और सतहों के साथ कैसे अंतःक्रिया करता है। उन्होंने प्रोटीन को माउस फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं (mouse fibroblast cells) की एक परत पर रखा, जो कि घाव भरने में शामिल कोशिकाओं का एक प्रकार है, और देखा कि कोशिकाएं एक अंतराल को भरने के लिए कितनी तेजी से आगे बढ़ती हैं। नए फ्यूजन प्रोटीन से उपचारित कोशिकाओं ने प्राकृतिक मसल प्रोटीन से उपचारित कोशिकाओं की तुलना में अंतराल को बहुत तेजी से भरा, तीन दिनों में 93.5 प्रतिशत घाव को बंद किया जबकि प्राकृतिक संस्करण के लिए यह 83.5 प्रतिशत था। प्रोटीन ने एक उत्कृष्ट कोटिंग एजेंट के रूप में भी अपनी क्षमता सिद्ध की। जब इसे कांच (एक बहुत गीली सतह) और पॉलिस्टाइरीन (एक मध्यम सूखी सतह) पर लगाया गया, तो यह मजबूती से और समान रूप से चिपका, जो अपने प्राकृतिक समकक्ष की तरह विविध सामग्रियों के साथ जुड़ने की अपनी क्षमता को प्रदर्शित करता है।
अंत में, टीम ने प्रोटीन की भौतिक प्रकृति को मापा ताकि यह समझा जा सके कि यह शरीर में कैसा व्यवहार करेगा। उन्होंने पाया कि यह सामग्री अविश्वसनीय रूप से नरम और लचीली है, जिसका इलास्टिक मॉड्यूलस (elastic modulus) 2.34 किलोपास्कल है। इस अत्यधिक कोमलता का अर्थ है कि प्रोटीन आसानी से घाव या ऊतक की सतह के आकार के अनुरूप हो सकता है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि यह कठोर या भंगुर हुए बिना एक मजबूत और सुरक्षित बंधन बनाए। एक फ्यूजन रणनीति को मिलाकर जो उत्पादन को बढ़ावा देती है और एक सह-अभिव्यक्ति (co-expression) प्रणाली को मिलाकर जो आवश्यक रासायनिक गतिविधि जोड़ती है, शोधकर्ताओं ने एक बायोएक्टिव एडहेसिव बनाने का एक स्केलेबल और कुशल तरीका विकसित किया है। यह कार्य एक ऐसे मार्ग का सुझाव देता है जो एक ऐसी सामग्री के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए व्यवहार्य है जो एक दिन हमारे घावों के उपचार, ऊतकों की मरम्मत और चिकित्सा सतहों के निर्माण के तरीके में सुधार कर सकती है।
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