Development and Analytical Validation of an In-House Quantitative Indirect ELISA for Detection of IgG Antibodies Against SARS-CoV-2 Spike Protein: A Pilot Study

जब SARS-CoV-2 जैसा वायरस मानव शरीर में प्रवेश करता है, तो प्रतिरक्षा प्रणाली एक विशेष रक्षा बल बनाने के लिए प्रतिक्रिया देती है। इन रक्षकों के बीच Y-आकार के प्रोटीन होते हैं जिन्हें एंटीबॉडी कहा जाता है, जो आणविक टैग की तरह कार्य करते हैं जो विशेष रूप से वायरस से चिपक जाते हैं, जिससे उसे विनाश के लिए चिह्नित किया जा सके। वैज्ञानिक संक्रमण समाप्त होने के बहुत समय बाद भी एक व्यक्ति के रक्त में इन एंटीबॉडी को पा सकते हैं, जो यह बताता है कि कौन किसके संपर्क में आया था। समय में पीछे देखने की इस क्षमता को सीरोलॉजी (serology) कहा जाता है, और यह समझने के लिए आवश्यक है कि संक्रमण कितना व्यापक रहा है, प्रतिरक्षा कितनी लंबी चलती है, और टीके कितनी अच्छी तरह काम कर रहे हैं। हालाँकि, कई देशों के लिए, इन परीक्षणों को करने के लिए आवश्यक उपकरण महंगे, आयातित और अक्सर आपूर्ति श्रृंखला बाधित होने पर अनुपलब्ध होते हैं। यह वैश्विक स्वास्थ्य सुरक्षा में एक खतरनाक अंतर पैदा करता है, जिससे राष्ट्र बाहरी मदद पर निर्भर हुए बिना वायरस के प्रसार को ट्रैक करने या भविष्य के प्रकोपों के लिए तैयार होने में असमर्थ हो जाते हैं।

इस चुनौती के जवाब में, मोरक्को के इंस्टिट्यूट पाश्चर और मोहम्मद VI पॉलिटेक्निक यूनिवर्सिटी के शोधकर्ताओं की एक टीम ने शून्य से अपना स्वयं का एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण बनाने का लक्ष्य रखा। उन्होंने विशेष रूप से SARS-CoV-2 वायरस के स्पाइक प्रोटीन को लक्षित करने वाले IgG एंटीबॉडी—जो लंबे समय तक चलने वाले रक्षक हैं—की मात्रा को मापने के लिए एक परीक्षण बनाने पर ध्यान केंद्रित किया। स्पाइक प्रोटीन वायरस का वह हिस्सा है जो इसे मानव कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति देता है, जिससे यह प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया का प्राथमिक लक्ष्य बन जाता है। शोधकर्ता केवल एक साधारण 'हाँ या ना' वाला परीक्षण नहीं चाहते थे; वे एक मात्रात्मक (quantitative) विधि चाहते थे, जो यह माप सके कि नमूने में वास्तव में कितनी एंटीबॉडी मौजूद है। यह सटीकता विभिन्न आबादी और समय के साथ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। उनका लक्ष्य यह सिद्ध करना था कि स्थानीय स्तर पर, मानक उपकरणों और सामग्रियों का उपयोग करके एक उच्च गुणवत्ता वाला, विश्वसनीय प्रयोगशाला परीक्षण विकसित किया जा सकता है, ताकि विदेशी वाणिज्यिक किटों पर निर्भरता कम की जा सके।

टीम ने अपने परीक्षण की स्थितियों को सावधानीपूर्वक ट्यून करने से शुरुआत की, जिसे एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट एसे (ELISA) के रूप में जाना जाता है। कल्पना कीजिए कि एक सपाट ट्रे है जिसमें छोटे कुएँ (wells) हैं, जैसे कि एक छोटा अंडे का कार्टन, जहाँ वायरस का स्पाइक प्रोटीन एक जाल के रूप में चिपकाया गया है। शोधकर्ताओं ने इस प्रोटीन की विभिन्न मात्राओं और रक्त के नमूनों को अलग-अलग तरीकों से पतला करने का परीक्षण किया ताकि वे सही संतुलन पा सकें। उन्होंने पाया कि स्पाइक प्रोटीन की एक विशिष्ट, मध्यम मात्रा का उपयोग करने और रक्त को सौ गुना पतला करने से सबसे स्पष्ट और सटीक परिणाम प्राप्त हुए। यदि वे बहुत अधिक प्रोटीन का उपयोग करते, तो संकेत संतृप्त (saturated) हो जाता और सटीकता खो देता; यदि वे रक्त को बहुत अधिक पतला करते, तो कमजोर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं छूट जातीं। इस 'स्वीट स्पॉट' को खोजकर, उन्होंने यह सुनिश्चित किया कि परीक्षण भ्रम के बिना मजबूत और कमजोर दोनों एंटीबॉडी स्तरों का पता लगा सके।

परीक्षण को मात्रात्मक बनाने के लिए, वैज्ञानिकों ने अपना आंतरिक पैमाना बनाया। उन्होंने कोविड-19 से ठीक हुए छह लोगों के रक्त नमूनों को मिलाकर एक मानक संदर्भ पूल (standard reference pool) बनाया। इस पूल को विभिन्न तनुकरण (dilutions) पर परीक्षण करके, उन्होंने एक अंशांकन वक्र (calibration curve) स्थापित किया, जो एक सीधी रेखा थी जिसने कच्चे रंग परिवर्तन को एंटीबॉडी की एक विशिष्ट सांद्रता (concentration) में बदलने की अनुमति दी। इस दृष्टिकोण का अर्थ था कि हर बार जब वे परीक्षण चलाते थे, तो वे परिणामों को प्रति मिलीलीटर मनमाने इकाइयों (arbitary units) में व्यक्त कर सकते थे, जिससे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्तरों को मापने का एक सुसंगत तरीका मिल गया। इस वक्र की रैखिकता (linearity) असाधारण रूप से मजबूत थी, जिसका अर्थ था कि परीक्षण उनके द्वारा अपेक्षित एंटीबॉडी सांद्रता की पूरी सीमा में अनुमानित रूप से प्रतिक्रिया करता था।

शोधकर्ताओं ने अपने नए परीक्षण को यह सुनिश्चित करने के लिए कठोर जांच के अधीन किया कि यह कितना विश्वसनीय और सटीक है। उन्होंने एक ही दिन में और अलग-अलग दिनों में एक ही नमूनों को कई बार चलाया ताकि यह देखा जा सके कि परिणाम कितने सुसंगत रहते हैं। उनके द्वारा पाए गए अंतर अत्यंत सूक्ष्म थे, जो चिकित्सा निदान के लिए आवश्यक सख्त सीमाओं के भीतर थे। उन्होंने एंटीबॉडी की उस न्यूनतम मात्रा की भी गणना की जिसे उनका परीक्षण विश्वसनीय रूप से पहचान सकता है, जिससे यह पुष्टि हुई कि यह यहाँ तक कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के निम्न स्तरों को खोजने के लिए भी पर्याप्त संवेदनशील है। ये विश्लेषणात्मक सीमाएँ वास्तविक सकारात्मक मामलों द्वारा उत्पन्न संकेतों से बहुत नीचे थीं, जिससे यह सुनिश्चित हुआ कि परीक्षण वास्तविक संक्रमणों को मिस नहीं करेगा। डेटा ने दिखाया कि परीक्षण मजबूत, पुनरुत्पादनीय (reproducible) था, और उच्च विश्वास के साथ सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों के बीच अंतर करने में सक्षम था।

अंत में, टीम ने यह देखने के लिए कि यह वास्तविक दुनिया के परिदृश्य में कैसा प्रदर्शन करता है, अपने नए तरीके का परीक्षण बीस रक्त नमूनों के एक छोटे, स्वतंत्र समूह पर किया। इनमें से दस नमूने सक्रिय संक्रमण वाले लोगों के थे, और दस नमूने उन लोगों के थे जिनका परीक्षण महामारी से पहले किया गया था। परीक्षण ने दस में से नौ संक्रमित व्यक्तियों और दस में से नौ संक्रमित न होने वाले व्यक्तियों की सही पहचान की। हालांकि एक संक्रमित व्यक्ति का पता नहीं चल सका, संभवतः इसलिए क्योंकि उनकी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उस समय इतनी कमजोर थी कि उसे पहचाना नहीं जा सका, और एक गैर-संक्रमित व्यक्ति ने एक सीमावर्ती (borderline) परिणाम दिखाया, फिर भी समग्र प्रदर्शन मजबूत था। परीक्षण ने उच्च सटीकता के साथ दोनों समूहों को सफलतापूर्वक अलग किया, जिससे यह प्रदर्शित हुआ कि एक स्थानीय रूप से विकसित, इन-हाउस परीक्षण वाणिज्यिक विकल्पों के समान परिणाम प्राप्त कर सकता है।

यह कार्य केवल एक वायरस के लिए नया परीक्षण मात्र नहीं है; यह सीमित संसाधनों वाले परिवेश में नैदानिक उपकरण बनाने के लिए एक पूर्ण, पुनरुत्पादनीय ब्लूप्रिंट स्थापित करता है। सटीकता और पहचान के अंतरराष्ट्रीय मानकों के विरुद्ध अपने तरीके को मान्य करके, शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि राष्ट्रीय प्रयोगशालाएं संक्रामक रोगों की निगरानी के लिए अपनी स्वयं की क्षमता विकसित कर सकती हैं। यह स्वतंत्रता महामारी की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे देश आयातित आपूर्ति की प्रतीक्षा किए बिना नए खतरों के प्रति तेजी से प्रतिक्रिया दे सकते हैं। हालांकि यह अध्ययन नमूनों की एक छोटी संख्या के साथ एक पायलट अध्ययन था, परिणाम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण व्यवहार्य और प्रभावी है। अगले चरणों में दीर्घकालिक सार्वजनिक स्वास्थ्य निगरानी के लिए इसकी उपयोगिता की पूर्ण पुष्टि करने हेतु, टीकाकृत या विभिन्न वेरिएंट से संक्रमित लोगों सहित बड़े, विविध समूहों पर इस पद्धति का परीक्षण करना शामिल होगा।