A Universal Untargeted Modification Metabolomics Pipeline for Profiling Plant Metabolite Modifications: Application to Wheat-Fusarium Head Blight Interactions

पौधे लगातार सूक्ष्मजीवों के खिलाफ एक मूक, रासायनिक युद्ध में लगे रहते हैं जो उन पर आक्रमण करने की कोशिश करते हैं। जब कोई कवक (फंगस) हमला करता है, तो पौधा केवल स्थिर नहीं खड़ा रहता; वह जवाबी कार्रवाई करने के लिए अपने आंतरिक रसायन विज्ञान को फिर से लिखता है। इस रासायनिक शस्त्रागार में सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक एक प्रक्रिया है जिसे 'संशोधन' (modification) कहा जाता है। एक पौधे के अणु को एक बुनियादी निर्माण खंड (building block) के रूप में कल्पना करें, जैसे कि एक सादा ईंट। उस ईंट को किसी विशिष्ट कार्य के लिए उपयोगी बनाने के लिए—चाहे वह ऊर्जा संग्रहीत करना हो, खतरे का संकेत देना हो, या किसी विष को बेअसर करना हो—पौधा उससे एक छोटा रासायनिक टैग जोड़ देता है। यह टैग एक शर्करा (sugar) अणु, एक फैटी एसिड, या एक जटिल प्रोटीन श्रृंखला हो सकता है। ये टैग इस बात को बदलते हैं कि अणु कैसे व्यवहार करता है, वह पौधे की कोशिका के भीतर कहाँ जाता है, और वह कितने समय तक रहता है। दशकों से, वैज्ञानिक जानते हैं कि ये संशोधन मौजूद हैं और महत्वपूर्ण हैं, लेकिन वे उन्हें स्पष्ट रूप से देखने के लिए संघर्ष करते रहे हैं। पौधों के रसायन विज्ञान का अध्ययन करने के विधियों के मानक तरीके उन सादे ईंटों की तस्वीरें लेने वाले कैमरे की तरह हैं, जो टैग वाले अणुओं को पूरी तरह से छोड़ देते हैं क्योंकि टैग उन अणुओं को अलग दिखाते हैं। इन टैग किए गए अणुओं को व्यवस्थित रूप से खोजने और पहचानने का तरीका न होने के कारण, पौधे की रक्षा रणनीति का एक बड़ा हिस्सा अदृश्य बना रहा।

शंघाई कृषि विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस समस्या को हल करने के लिए एक नया उपकरण बनाया है, जिससे वे अंततः इन सक्रिय रासायनिक टैगों के पूर्ण परिदृश्य को देख पा रहे हैं। उन्होंने एक परिष्कृत पाइपलाइन विकसित की है जो एक जटिल पौधे के अर्क (extract) को स्कैन कर सकती है और बिना यह जाने कि वे पहले से क्या खोज रहे हैं, एक साथ बीस से अधिक विभिन्न प्रकार के रासायनिक संशोधनों को स्वचालित रूप से पहचान सकती है। इस नई पद्धति का परीक्षण करने के लिए, उन्होंने कृषि में एक क्लासिक लड़ाई की ओर रुख किया: गेहूं और फ्यूसेरियम हेड ब्लाइट (Fusarium head blight) के बीच का संघर्ष, जो एक विनाशकारी कवक रोग है जो फसलों को नष्ट कर देता है और अनाज को विषाक्त पदार्थों से दूषित कर देता है। उन्होंने बीमारी के प्रति मजबूत प्रतिरोध दिखाने वाली गेहूं की एक किस्म और अत्यधिक संवेदनशील किस्म की तुलना की। समय के साथ रासायनिक परिवर्तनों को ट्रैक करके, शोधकर्ताओं ने पाया कि प्रतिरोधी गेहूं एक तीव्र, संगठित रासायनिक रक्षा प्रणाली अपनाता है, जबकि संवेदनशील गेहूं बहुत धीमी और अराजक प्रतिक्रिया देता है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि उनके नए उपकरण ने विशिष्ट टैग किए गए अणुओं को उजागर किया जो इस प्रतिरोध की कुंजी के रूप में कार्य करते हैं, जिससे जीव विज्ञान की एक छिपी हुई परत का पता चला जिसे पिछले तरीके नहीं देख सके थे।

शोधकर्ताओं ने एक नियंत्रित वातावरण में गेहूं के दो प्रकार उगाकर शुरुआत की: वांगशुइबाई (Wangshuibai), जो संक्रमण का सामना करने की क्षमता के लिए जाना जाने वाला एक लैंडरेस है, और फील्डर (Fielder), जो इस बीमारी के प्रति आसानी से हार मान लेता है। उन्होंने दोनों पौधों के फूलों वाले सिरों (flowering heads) को कवक के साथ संक्रमित किया और तीन महत्वपूर्ण क्षणों पर नमूने एकत्र किए: संक्रमण से ठीक पहले, छह दिन बाद, और बीस दिन बाद। प्रत्येक चरण में, उन्होंने पौधे के ऊतकों से रसायनों को निकाला और उन्हें एक उच्च-परिशुद्धता वाले मास स्पेक्ट्रोमीटर (mass spectrometer) से गुजारा, जो अत्यधिक सटीकता के साथ अणुओं का वजन करता है। उनके दृष्टिकोण में नवाचार यह था कि उन्होंने मशीन को रासायनिक टैगों को खोजने के लिए कैसे प्रोग्राम किया। विशिष्ट ज्ञात अणुओं की खोज करने के बजाय, उन्होंने मशीन को एक पैटर्न खोजने के लिए सेट किया: एक विशिष्ट वजन की कमी जो तब होती है जब एक अणु टूट जाता है। उन्होंने सिस्टम को उन्नीस अलग-अलग वजन-हानि पैटर्न को पहचानने के लिए प्रोग्राम किया, जिनमें से प्रत्येक एक सामान्य प्रकार के रासायनिक टैग, जैसे कि शर्करा समूह या ग्लूटाथियोन अणु के अनुरूप था। जब मशीन ने इनमें से एक पैटर्न देखा, तो उसने स्वचालित रूप से उस अणु की पहचान करने के लिए गहन विश्लेषण शुरू कर दिया जो उस टैग को ले जा रहा था।

यह नया वर्कफ़्लो उल्लेखनीय रूप से प्रभावी साबित हुआ। गेहूं के सिर में पाए जाने वाले रसायनों के जटिल मिश्रण में, सिस्टम ने लगभग नौ हजार अलग-अलग अणुओं की पहचान की। इनमें से, लगभग उन्नीस प्रतिशत को संशोधित रूपों के रूप में पाया गया, जो उन रासायनिक टैगों को ले जा रहे थे जिनकी शोधकर्ता तलाश कर रहे थे। यह एक महत्वपूर्ण खोज है क्योंकि मानक विधियां इनमें से अधिकांश को चूक जातीं, उन्हें अज्ञात मान लेतीं या पूरी तरह से अनदेखा कर देतीं। सबसे आम टैग शर्करा थे, जो अणुओं से जुड़कर उन्हें अधिक घुलनशील या स्थिर बनाते हैं; एसिटाइल समूह (acetyl groups), जो अक्सर एक अणु के कार्य को बदलते हैं; और ग्लूटाथियोन श्रृंखलाएं, जो हानिकारक पदार्थों को विषमुक्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। अध्ययन ने दिखाया कि ये संशोधन यादृच्छिक नहीं हैं; वे एक खतरे के प्रति एक गतिशील प्रतिक्रिया हैं। प्रतिरोधी गेहूं की किस्म, वांगशुइबाई, संक्रमण के दौरान इन संशोधित अणुओं में एक तीव्र और समन्वित उछाल दिखाती है, जो एक त्वरित और संगठित रक्षा रणनीति का सुझाव देती है। इसके विपरीत, संवेदनशील फील्डर किस्म ने एक विलंबित प्रतिक्रिया दिखाई, जिसमें सबसे तीव्र रासायनिक परिवर्तन संक्रमण के अंतिम चरण में हुए, जो कवक के स्थापित होने के बहुत बाद में हुआ।

हजारों संशोधित अणुओं के बीच, शोधकर्ताओं को दो ऐसे मिले जो प्रतिरोध के संभावित मार्कर के रूप में उभरे। एक अणु था इंडोल-3-एसिटिल-बीटा-1-डी-ग्लूकोसाइड (indole-3-acetyl-beta-1-D-glucoside), जो एक पौधे के हार्मोन ऑक्सिन (auxin) का एक शर्करा-टैग्ड संस्करण है। दूसरा डेऑक्सीनिवलenol (deoxynivalenol) नामक कवक विष का एक ग्लूटाथियोन-टैग्ड संस्करण है। ये दोनों अणु संवेदनशील किस्म की तुलना में प्रतिरोधी गेहूं में काफी अधिक मात्रा में पाए गए। शर्करा-टैग्ड हार्मोन की उपस्थिति यह सुझाव देती है कि प्रतिरोधी पौधा अपने आंतरिक सिग्नलिंग सिस्टम को सावधानीपूर्वक प्रबंधित कर रहा है, शायद सक्रिय हार्मोन को दूर रख रहा है ताकि कवक उनका उपयोग न कर सके। विष-टैग्ड अणु का संचय इस बात का सीधा प्रमाण प्रदान करता है कि प्रतिरोखी पौधा एक सुरक्षात्मक रासायनिक श्रृंखला को उससे जोड़कर कवक के जहर को सफलतापूर्वक बेअसर कर रहा है। ये विशिष्ट अणु पुराने तकनीकों के लिए अदृश्य होते क्योंकि टैग ने उनकी रासायनिक पहचान को इतना बदल दिया था कि वे मानक डेटाबेस को भ्रमित कर सकें। तथ्य यह है कि वे केवल प्रतिरोधी पौधे में, और केवल कवक के हमले के बाद ही उच्च मात्रा में दिखाई देते हैं, यह संकेत देता है कि वे केवल आकस्मिक उपोत्पाद होने के बजाय रक्षा में सक्रिय भागीदार हैं।

अध्ययन ने यह भी रेखांकित किया कि जब रक्षा विफल हो जाती है तो क्या होता है। संवेदनशील गेहूं में, शोधकर्ताओं ने विभिन्न प्रकार के संशोधित अणुओं का संचय देखा, जिसमें शर्करा-टैग्ड फ्लेवोनोइड्स और एसिटिलेटेड अमीनो एसिड शामिल थे, लेकिन ये संक्रमण की प्रक्रिया के अंत में दिखाई दिए। यह पैटर्न एक अव्यवस्थित तनाव प्रतिक्रिया का सुझाव देता है, जहाँ पौधा एक सटीक रक्षा रणनीति निष्पादित करने के बजाय क्षति से निपटने के लिए संघर्ष कर रहा है। शोधकर्ताओं ने नोट किया कि हालांकि वे अपने द्रव्यमान और विखंडन पैटर्न के आधार पर इन अणुओं की उच्च विश्वास के साथ पहचान कर सकते थे, लेकिन वे प्रत्येक की सटीक संरचना की पुष्टि भौतिक संदर्भ नमूने के बिना नहीं कर सके, क्योंकि इनमें से अधिकांश संशोधित रसायन वाणिज्यिक आपूर्ति में मौजूद नहीं हैं। हालांकि, डेटा की निरंतरता और प्रतिरोधी तथा संवेदनशील पौधों के बीच स्पष्ट अंतर इन निष्कर्षों के जैविक महत्व के लिए मजबूत प्रमाण प्रदान करते है।

यह कार्य इस बात में बदलाव है कि वैज्ञानिक पौधों के जीव विज्ञान का अध्ययन कैसे कर सकते हैं। एक ऐसी विधि बनाकर, जिसमें संदिग्धों की पूर्व-निर्धारित सूची की आवश्यकता नहीं है, शोधकर्ताओं ने उन नई रासायनिक रणनीतियों की खोज का द्वार खोल दिया है जिनका उपयोग पौधे जीवित रहने के लिए करते हैं। "मॉडिफ़िकोम" (modificome)—अर्थात संशोधित अणुओं का पूर्ण संग्रह—को देखने की क्षमता उस जटिलता को प्रकट करती है जो पहले छिपी हुई थी। गेहूं और फ्यूसेरियम के संदर्भ में, यह नया दृष्टिकोण बताता है कि प्रतिरोध केवल एक निश्चित रसायन के उत्पादन के बारे में नहीं है, बल्कि इस बारे में है कि पौधे लड़ने के लिए अपने मौजूदा रसायनों को कितनी तेजी से और सटीकता से संशोधित करते हैं। शर्करा-हार्मोन और विष-निरोधक जैसे विशिष्ट टैग किए गए अणुओं की खोज उन ब्रीडर्स (breeders) के लिए नए लक्ष्य प्रदान करती है जो अधिक लचीले गेहूं की किस्में विकसित करना चाहते हैं। जैसा कि शोधकर्ता बताते हैं, यह पाइपलाइन केवल गेहूं या कवक संक्रमण तक सीमित नहीं है; इसे किसी भी ऐसी स्थिति में लागू किया जा सकता है जहाँ एक पौधा तनाव का सामना करता है, सूखे से लेकर कीट हमलों तक, जो संभावित रूप से उस छिपी हुई रासायनिक भाषा को प्रकट कर सकता है जिसका उपयोग पौधे एक चुनौतीपूर्ण दुनिया में जीवित रहने के लिए करते हैं।