Evaluating Computational Tools for CRISPR-Cas9 Design: A Case Study on the TP53 Gene

जीनोम एडिटिंग एक शक्तिशाली तकनीक है जो वैज्ञानिकों को जीवन के कोड को फिर से लिखने की अनुमति देती है, ठीक वैसे ही जैसे एक वर्ड प्रोसेसर एक लेखक को पांडुलिपि में विशिष्ट शब्दों को खोजने और बदलने की अनुमति देता है। इस तकनीक के केंद्र में CRISPR-Cas9 नामक एक आणविक उपकरण है, जो आणविक कैंची की एक जोड़ी के रूप में कार्य करता है। इन कैंचियों का प्रभावी ढंग से उपयोग करने के लिए, शोधकर्ताओं को एक बहुत ही विशिष्ट गाइड डिजाइन करनी चाहिए, जो एक छोटा जेनेटिक मटेरियल स्ट्रैंड है जिसे 'गाइड आरएनए' (guide RNA) के रूप में जाना जाता है, जो कैंची को डीएनए के उस सटीक स्थान तक ले जाता है जहाँ वे कट लगाना चाहते हैं। यदि गाइड सटीक है, तो कट केवल वहीं होता है जहाँ इरादा था, जिससे वैज्ञानिक एक दोषपूर्ण जीन को अक्षम कर सकते हैं या यह अध्ययन कर सकते हैं कि एक कोशिका कैसे कार्य करती है। हालांकि, यदि गाइड थोड़ी भी गलत है, तो कैंची गलत जगह पर कट लगा सकती है, जिससे जीनोम को अनचाहा नुकसान हो सकता है। चूंकि मानव जीनोम विशाल और जटिल है, इसलिए एक आदर्श गाइड खोजना कठिन है, इसलिए वैज्ञानिक कंप्यूटर प्रोग्रामों पर भरोसा करते हैं जो यह भविष्यवाणी करते हैं कि कौन से गाइड सबसे अच्छा काम करेंगे और कौन से समस्या पैदा कर सकते हैं।

चुनौती यह है कि ये कंप्यूटर प्रोग्राम एक जैसा नहीं सोचते। वे यह तय करने के लिए अलग-अलग गणितीय नियमों का उपयोग करते हैं कि कौन सा गाइड सबसे अच्छा विकल्प है। कुछ प्रोग्राम इस बात को प्राथमिकता देते हैं कि लक्ष्य को काटने की दक्षता कितनी अधिक होगी, जबकि अन्य जीनोम के अन्य हिस्सों में आकस्मिक कट से बचने पर अधिक ध्यान केंद्रित करते हैं। तर्क में इस अंतर का अर्थ है कि एक ही जीन को देख रहे दो प्रोग्राम पूरी तरह से अलग गाइडों की सिफारिश कर सकते हैं। यह अनिश्चितता शोधकर्ताओं के लिए एक दुविधा पैदा करती है: यदि वे केवल एक प्रोग्राम पर भरोसा करते हैं, तो वे एक बेहतर विकल्प को मिस कर सकते हैं या, इससे भी बुरा, एक ऐसा गाइड चुन सकते हैं जो खतरनाक हो। इस समस्या को हल करने के लिए, रोमानिया के शोधकर्ताओं की एक टीम ने यह परीक्षण करने के लिए कदम उठाया कि जब TP53 नामक एक विशिष्ट, महत्वपूर्ण जीन के लिए गाइड डिजाइन किया जाता है, तो ये विभिन्न कंप्यूटर प्रोग्राम कैसे तुलना करते हैं। यह जीन कोशिका के संरक्षक के रूप में कार्य करता है, और जब यह खराब होता है, तो यह अक्सर कैंसर के विकास में शामिल होता है। शोधकर्ताओं ने इस जीन के एक छोटे हिस्से पर ध्यान केंद्रित किया जिसे एक्सॉन 5 (Exon 5) कहा जाता है, एक ऐसा क्षेत्र जहाँ उत्परिवर्तन (mutations) अक्सर होते हैं।

टीम ने इस खंड के सटीक डीएनए अनुक्रम को लिया और इसे उपलब्ध तीन सबसे लोकप्रिय कंप्यूटर डिजाइन टूल्स में से एक में डाला: CHOPCHOP, Benchling, और IDT का Alt-R CRISPR डिज़ाइन टूल। उन्होंने प्रत्येक प्रोग्राम से इस विशिष्ट स्थान को काटने के लिए शीर्ष तीन सर्वश्रेष्ठ गाइड खोजने को कहा। परिणामों ने यह स्पष्ट किया कि ये उपकरण कैसे काम करते हैं। पहले दो प्रोग्राम, CHOPCHOP और Benchling, वास्तव में अपने शीर्ष उम्मीदवारों के रूप में एक ही तीन जेनेटिक अनुक्रमों को पाते हैं। हालांकि, वे उनके क्रम पर असहमत थे। एक प्रोग्राम ने एक विशिष्ट अनुक्रम को तीसरे सबसे अच्छे विकल्प के रूप में रैंक किया क्योंकि उसमें गलत जगह कट लगाने का थोड़ा अधिक जोखिम था, जबकि दूसरे प्रोग्राम ने उसी अनुक्रम को सबसे अच्छे विकल्प के रूप में रैंक किया क्योंकि वह अत्यंत सुरक्षित था। ऐसा इसलिए हुआ क्योंकि दोनों प्रोग्राम काटने की गति बनाम सुरक्षा के महत्व को अलग-अलग तरीके से तौलते हैं। एक प्रोग्राम आकस्मिक कट के मामूली जोखिम को स्वीकार करने के लिए अधिक तैयार है यदि इसका मतलब यह है कि गाइड तेजी से काम करेगा, जबकि दूसरा अधिक सतर्क है और सुरक्षा को सर्वोपरि रखता है।

तीसरे टूल, IDT के Alt-R ने एक पूरी तरह से अलग कहानी बताई। इसने अन्य दो प्रोग्रामों के समान शीर्ष तीन अनुक्रमों में से किसी की भी सिफारिश नहीं की। इसके बजाय, इसने एक बिल्कुल अलग गाइड की ओर इशारा किया, जिसे अन्य प्रोग्रामों ने बहुत नीचे रखा था। यह गाइड लक्ष्य को काटने में सबसे कुशल होने की भविष्यवाणी की गई थी, जिसकी सफलता दर 7 प्रतिशत थी, लेकिन अन्य प्रोग्रामों ने इसे अपनी सूचियों में बहुत नीचे रखा था क्योंकि उन्होंने इसके सुरक्षा स्कोर की गणना अलग तरह से की थी। शोधकर्ताओं ने पाया कि यह विसंगति इसलिए मौजूद है क्योंकि IDT टूल प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपयोग किए जाने वाले सिंथेटिक गाइड्स के लिए एक विशिष्ट मॉडल के साथ डिज़ाइन किया गया है, जो जीवित कोशिकाओं के भीतर स्वाभाविक रूप से उत्पन्न होने वाले गाइड्स की तुलना में थोड़ा अलग व्यवहार करते हैं। अन्य दो उपकरण इस आधार पर मॉडल का उपयोग करते हैं कि जीवित जीवों के भीतर मशीनरी कैसे काम करती है। इन अलग-अलग अंतर्निहित नियमों के कारण, IDT टूल ने संभावनाओं का एक अलग परिदृश्य देखा और एक ऐसा गाइड चुना जिसे अन्यों ने अनदेखा कर दिया था।

अध्ययन यह निष्कर्ष निकालता है कि केवल एक कंप्यूटर प्रोग्राम पर भरोसा करना एक जोखिम भरी रणनीति है। यदि किसी शोधकर्ता ने केवल पहले टूल का उपयोग किया होता, तो उन्होंने एक ऐसा गाइड चुना होता जो सुरक्षित तो है लेकिन कम कुशल है। यदि उन्होंने केवल तीसरे टूल का उपयोग किया होता, तो उन्होंने एक अत्यधिक कुशल गाइड चुना होता जिसे अन्य टूल्स ने संभावित रूप से कम सुरक्षित बताया था। शोधकर्ता सुझाव देते हैं कि सबसे अच्छा दृष्टिकोण कई प्रोग्रामों के परिणामों को देखना और उन गाइड्स को खोजना है जो कई अलग-अलग टूल्स की सूचियों में दिखाई देते हैं। मानक प्रयोगों के लिए, उन्होंने एक ऐसा गाइड पहचाना जिसे CHOPCHOP और Benchling दोनों ने मजबूत और सुरक्षित पाया। सिंथेटिक गाइड्स का उपयोग करने वाले प्रयोगों के लिए, उन्होंने IDT टूल द्वारा अनुशंसित अद्वितीय गाइड की ओर इशारा किया। यह कार्य इस बात पर प्रकाश डालता है कि ये कंप्यूटर उपकरण पूर्ण, स्वचालित उत्तर नहीं हैं बल्कि जटिल कैलकुलेटर हैं जिनमें मानवीय निर्णय की आवश्यकता होती है। जीनोम एडिटिंग की सुरक्षा और सफलता सुनिश्चित करने के लिए, वैज्ञानिकों को अपने विकल्पों को विभिन्न प्लेटफार्मों पर क्रॉस-चेक करना चाहिए, यह समझते हुए कि प्रत्येक प्रोग्राम एक ही जेनेटिक कोड पर एक अलग दृष्टिकोण प्रदान करता है।