Development and Application of a Multiplex PCR Assay for Detection of Clostridium perfringens, Clostridium novyi, Clostridium septicum and Clostridium chauvoei

पशुपालन की दुनिया में, मिट्टी और मवेशियों तथा भेड़ों की आंतों में अक्सर एक शांत और अचानक मंडराता खतरा छिपा रहता है। ये खतरे क्लॉस्ट्रिडियम (Clostridium) नामक बैक्टीरिया हैं, जो सूक्ष्म जीव हैं और कठोर वातावरण में जीवित रहने के लिए स्पोर (spore) नामक मजबूत, सुप्त कवच बनाते हैं। जब स्थितियाँ बदलती हैं, तो ये स्पोर जाग जाते हैं, तेजी से संख्या बढ़ाते हैं, और शक्तिशाली जहर छोड़ते हैं जो कुछ ही घंटों के भीतर किसी जानवर को मार सकते हैं। इन बैक्टीरिया के चार विशिष्ट प्रकार—क्लॉस्ट्रिडियम परफ्रिंगेन्स (Clostridium perfringens), क्लॉस्ट्रिडियम नोवी (Clostridium novyi), क्लॉस्ट्रिडियम सेप्टिकम (Clostridium septicum), और क्लॉस्ट्रिडियम चाउवेई (Clostridium chauvoei)—उन विनाशकारी बीमारियों के लिए जिम्मेदार हैं जो अचानक मृत्यु, गंभीर सूजन और ऊतकों के क्षय का कारण बनती हैं। पशु चिकित्सकों और किसानों के लिए चुनौती यह है कि शुरुआती चरणों में ये बीमारियाँ लगभग एक जैसी दिखती हैं, और जानवर अक्सर एक साथ एक से अधिक प्रकार के बैक्टीरिया के वाहक होते हैं। अपराधी की पहचान करने के पारंपरिक तरीकों में प्रयोगशाला में बैक्टीरिया को उगाना शामिल है, जो एक धीमी प्रक्रिया है जिसमें कई दिन लग सकते हैं और अक्सर विफल हो जाती है क्योंकि इन बैक्टीरिया को उनके प्राकृतिक वातावरण के बाहर जीवित रखना कठिन होता है। जब तक निदान किया जाता है, तब तक झुंड का इलाज करने या प्रकोप को समझने का अवसर निकल चुका होता है।

इस समस्या को हल करने के लिए, चीन के शोधकर्ताओं ने इन चार खतरनाक बैक्टीरिया की एक साथ पहचान करने का एक नया, तेज़ तरीका विकसित किया है। बैक्टीरिया के बढ़ने का इंतज़ार करने के बजाय, टीम ने एक ऐसा परीक्षण बनाया जो सीधे एक नमूने से प्रत्येक प्रजाति के अद्वितीय जेनेटिक फिंगरप्रिंट (आनुवंशिक छाप) की पहचान करता है। उन्होंने डीएनए के उन विशिष्ट खंडों पर ध्यान केंद्रित किया जो प्रत्येक बैक्टीरिया के लिए एक हस्ताक्षर के रूप में कार्य करते हैं: पहले प्रकार के लिए 'plc' नामक जीन, दूसरे के लिए 'fliC', तीसरे के लिए एक टॉक्सिन जीन, और चौथे के लिए 'cctA'। प्रत्येक विशिष्ट अनुक्रम (sequence) से जुड़ने वाले विशेष आणविक प्रोब (molecular probes) को डिजाइन करके, वैज्ञानिकों ने एक ऐसी प्रणाली बनाई जो एक ही ट्यूब में चार अलग-अलग परीक्षण चलाने में सक्षम है। यह दृष्टिकोण, जिसे मल्टीप्लेक्स पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (multiplex polymerase chain reaction) कहा जाता है, एक नमूने को एक ही बार में चारों रोगजनकों (pathogens) के लिए स्क्रीन करने की अनुमति देता है, जिससे एक ऐसी प्रक्रिया जो आमतौर पर कई दिनों में पूरी होती है, कुछ ही घंटों में संपन्न हो सकती है।

शोधकर्ताओं ने इन जेनेटिक लक्ष्यों को सावधानीपूर्वक चुनने और परीक्षण करने से शुरुआत की ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे एक बैक्टीरिया को दूसरे के रूप में न समझ लें या उन हानिरहित बैक्टीरिया के साथ प्रतिक्रिया न करें जो उसी नमूने में मौजूद हो सकते हैं। उन्होंने अन्य सामान्य रोगजनकों, जिनमें ई. कोलाई (E. coli) के विभिन्न प्रकार, साल्मोनेला (Salmonella) और पशुओं एवं भेड़ों को प्रभावित करने वाले विभिन्न वायरस शामिल थे, के विरुद्ध इस प्रणाली का परीक्षण किया। परिणामों ने दिखाया कि परीक्षण अत्यधिक सटीक था; यह केवल तभी सक्रिय हुआ जब चारों लक्षित बैक्टीरिया मौजूद थे और अन्य किसी भी चीज़ के सामने शांत रहा। टीम ने प्रतिक्रिया की स्थितियों को परिष्कृत किया, तापमान और उपयोग किए गए जेनेटिक मटेरियल की मात्रा को समायोजित किया, ताकि वह आदर्श संतुलन मिल सके जहाँ बिना किसी हस्तक्षेप के चारों लक्ष्यों का स्पष्ट रूप से पता लगाया जा सके। उन्होंने पाया कि 55 डिग्री सेल्सियस के विशिष्ट तापमान पर तीस चक्रों (cycles) के लिए परीक्षण चलाने से सबसे स्पष्ट परिणाम प्राप्त हुए।

एक बार जब विधि पूर्ण हो गई, तो टीम ने इसकी संवेदनशीलता (sensitivity) का परीक्षण करने के लिए कि यह कितने कम बैक्टीरिया का पता लगा सकती है। उन्होंने ज्ञात, सूक्ष्म मात्रा में बैक्टीरिया के डीएनए वाले कृत्रिम नमूने बनाए और पाया कि परीक्षण एक बैक्टीरिया के जेनेटिक मटेरियल के केवल एक सौ प्रतियों और दूसरे के लिए दस हजार प्रतियों तक का पता लगा सकता है। संवेदनशीलता का यह स्तर यह सुनिश्चित करता है कि परीक्षण संक्रमण की पहचान तब भी कर सकता है जब बैक्टीरिया बहुत कम संख्या में मौजूद हों, इससे बहुत पहले कि जानवर बीमारी के स्पष्ट लक्षण दिखाएं। शोधकर्ताओं ने यह भी जांचा कि क्या परीक्षण हर बार चलाने पर समान परिणाम देता है, जिससे यह पुष्टि हुई कि यह विभिन्न दिनों और विभिन्न ऑपरेटरों के बीच विश्वसनीय और सुसंगत है।

यह देखने के लिए कि वास्तविक दुनिया में यह परीक्षण कैसा प्रदर्शन करता है, टीम ने विभिन्न फार्मों पर मवेशियों और भेड़ों के गुदा स्वैब (anal swabs) से दो सौ छह नमूने एकत्र किए। उन्होंने सटीकता सुनिश्चित करने के लिए इन नमूनों पर नए मल्टीप्लेक्स परीक्षण को चलाया और पुराने, एकल-लक्ष्य परीक्षणों के साथ इसके परिणामों की तुलना की। नया तरीका पुराने परीक्षणों से बिल्कुल मेल खाता था लेकिन बहुत तेज़ी से। परिणामों से पता चला कि जबकि पहले प्रकार के बैक्टीरिया, क्लॉस्ट्रिडियम परफ्रिंगेन्स, में से कोई भी नमूना में मौजूद नहीं था, अन्य तीन मौजूद थे। क्लॉस्ट्रिडियम नोवी दो प्रतिशत जानवरों में पाया गया, क्लॉस्ट्रिडियम सेप्टिकम बारह प्रतिशत में, और क्लॉस्ट्रिडियम चाउवेई नौ प्रतिशत में पाया गया। शायद सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि परीक्षण ने दस नमूनों में मिश्रित संक्रमणों (mixed infections) की पहचान की, जिससे पता चला कि कुछ जानवर एक ही समय में दो अलग-अलग प्रकार के बैक्टीरिया के वाहक थे। यह खोज महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सुझाव देती है कि बीमारी रोगजनकों के एक संयोजन द्वारा संचालित हो सकती है, एक ऐसा विवरण जिसे एकल-लक्ष्य परीक्षण मिस कर सकता है।

अध्ययन निष्कर्ष निकालता है कि यह नई परीक्षण विधि पशुधन की सुरक्षा के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इन चार विशिष्ट बैक्टीरिया का त्वरित, सटीक और व्यापक तरीके से पता लगाने के लिए एक तरीका प्रदान करके, यह परीक्षण किसानों और पशु चिकित्सकों को यह समझने में मदद करता है कि उनके झुंडों में वास्तव में क्या हो रहा है। यह उपचार और रोकथाम पर त्वरित निर्णय लेने की अनुमति देता है, जैसे कि लक्षित टीकाकरण या फार्म प्रबंधन में बदलाव। हालांकि वर्तमान में यह परीक्षण इन चार प्रजातियों पर केंद्रित है, इस दृष्टिकोण की सफलता यह सुझाव देती है कि भविष्य में अन्य खतरनाक बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए इसी तरह की विधियाँ विकसित की जा सकती हैं, जो दुनिया को खिलाने वाले जानवरों के स्वास्थ्य में एक स्पष्ट खिड़की प्रदान करती हैं।