Engineering of Halohydrin Dehalogenase IcHheG via Semi-Rational Design for Enantioselective Synthesis of (R)-5-Phenoxymethyl-2-Oxazolidinone

दवाओं और जटिल रसायनों के निर्माण की दुनिया में, एक अणु का आकार उसके अवयवों जितना ही महत्वपूर्ण होता है। कई उपयोगी यौगिक दो रूपों में मौजूद होते हैं जो एक-दूसरे के दर्पण प्रतिबिंब (mirror images) होते हैं, जैसे एक बायां हाथ और एक दायां हाथ। हालांकि वे दर्पण में बिल्कुल समान दिखते हैं, लेकिन मानव शरीर के भीतर वे बहुत अलग व्यवहार करते हैं। उनका एक संस्करण किसी बीमारी को ठीक कर सकता है, जबकि उसका दर्पण प्रतिबिंब बेकार या यहाँ तक कि हानिकारक भी हो सकता है। दशकों से, वैज्ञानिक इन अणुओं को इस तरह बनाने के लिए संघर्ष कर रहे हैं ताकि वे सभी एक ही "हाथ की दिशा" (handedness) के हों, एक ऐसी प्रक्रिया जो अक्सर कठिन, महंगी और कठोर रसायनों पर निर्भर होती है। हालाँकि, प्रकृति ने पहले ही इस समस्या को हल कर लिया है। जीवित कोशिकाओं के भीतर, एंजाइम नामक सूक्ष्म जैविक मशीनें सटीक उपकरण के रूप में कार्य करती हैं, जो केवल एक विशिष्ट आकार बनाती हैं और दूसरे को अनदेखा कर देती हैं। शोधकर्ता अब इन एंजाइमों को नए, उपयोगी आकार बनाने के लिए प्रशिक्षित करना सीख रहे हैं जो प्रकृति सामान्यतः नहीं बनाती है, जिससे आधुनिक चिकित्सा के निर्माण खंडों (building blocks) को बनाने का एक स्वच्छ और अधिक कुशल तरीका मिलता है।

ऐसा ही एक निर्माण खंड ऑक्साज़ोलिडिनोन (oxazolidinones) नामक वलय-आकार के अणुओं का एक वर्ग है। ये संरचनाएं एंटीबायोटिक्स और अन्य दवाओं को बनाने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैं, फिर भी उन्हें शुद्ध, एकल-हाथ वाले रूप में बनाना एक निरंतर चुनौती रही है। पारंपरिक तरीकों के लिए अक्सर प्रतिक्रिया को मजबूर करने के लिए जहरीली गैसों या अत्यधिक स्थितियों की आवश्यकता होती है, और फिर भी, परिणाम अक्सर अस्त-व्यस्त होते हैं, जो दोनों दर्पण-प्रतिबिंब रूपों का मिश्रण पैदा करते हैं। नानजिंग नॉर्मल यूनिवर्सिटी के शोधकर्ताओं ने एक विशिष्ट एंजाइम को इंजीनियर करके इसे हल करने का लक्ष्य रखा, जो एक मिट्टी के जीवाणु (soil bacterium) में प्राकृतिक रूप से पाया जाने वाला प्रोटीन है, ताकि वह इस कार्य के लिए एक कुशल शिल्पकार बन सके। उनका लक्ष्य एंजाइम को (R)-5-फिनोक्सीमिथाइल-2-ऑक्साज़ोलिडिनोन नामक अणु के एक विशिष्ट संस्करण को उच्च सटीकता के साथ बनाने के लिए निर्देशित करना था, जिसका उपयोग एक सौम्य और पर्यावरण के अनुकूल तरीके से किया जा सके।

वैज्ञानिकों ने हैलोहाइड्रिन डीहैलोजीनेज (halohydrin dehalogenase) नामक एक एंजाइम से शुरुआत की, जो स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया को कुछ रसायनों को तोड़ने में मदद करता है। अपने मूल रूप में, यह एंजाइम नए अणु के लिए सही आकार चुनने में बहुत अच्छा नहीं था; इसने दोनों दर्पण-प्रतिबिंब रूपों का मिश्रण तैयार किया जिसमें बहुत कम प्राथमिकता थी। इसे ठीक करने के लिए, शोधकर्ताओं ने केवल अनुमान नहीं लगाया कि एंजाइम के किन हिस्सों को बदलना है। इसके बजाय, उन्होंने कंप्यूटर मॉडल का उपयोग करके एंजाइम की संरचना का अध्ययन किया और उन विशिष्ट स्थानों की पहचान की जहाँ कच्चे माल एंजाइम के सक्रिय स्थल (active site) में प्रवेश करते हैं। उन्होंने एंजाइम के साथ एक ऐसे ताले की तरह व्यवहार किया जिसे केवल एक विशिष्ट चाबी के फिट होने के लिए नया आकार देने की आवश्यकता थी। सिमुलेशन चलाकर और प्रोटीन के आंतरिक सुरंगों का विश्लेषण करके, उन्होंने दो विशिष्ट स्थानों, जिन्हें L103 और N196 लेबल किया गया था, को समायोजन करने के लिए सबसे आशाजनक स्थानों के रूप में पहचाना।

सेमी-रेशनल डिज़ाइन (semi-rational design) नामक तकनीक का उपयोग करते हुए, टीम ने इन दो स्थानों पर प्राकृतिक अमीनो एसिड को व्यवस्थित रूप से अलग-अलग अमीनो एसिड से बदल दिया, जिससे हजारों थोड़े अलग एंजाइम संस्करणों का एक पुस्तकालय तैयार हुआ। उन्होंने इन वेरिएंट्स का परीक्षण यह देखने के लिए किया कि कौन से वेरिएंट शुरुआती सामग्री के दोनों दर्पण-प्रतिबिंब रूपों के बीच सबसे अच्छी तरह अंतर कर सकते हैं। अधिकांश परिवर्तनों ने या तो एंजाइम को खराब कर दिया या कोई अंतर नहीं दिखाया, लेकिन कुछ ने आशा दिखाई। शोधकर्ताओं ने पाया कि स्थिति 103 पर अमीनो एसिड को हिस्टिडाइन (histidine) में और स्थिति 196 पर ट्रिप्टोफैन (tryptophan) में बदलने से एक शक्तिशाली नया एंजाइम संस्करण तैयार हुआ। यह डबल म्यूटेंट, जिसे L103H/N196W नाम दिया गया, उल्लेखनीय एकाग्रता के साथ कार्य करता था। जब इसे शुरुआती सामग्रियों के मिश्रण के साथ दिया गया, तो इसने लगभग विशेष रूप से वांछित (R) संस्करण का निर्माण किया, जिससे 95 प्रतिशत का शुद्धता स्तर प्राप्त हुआ।

टीम ने इस खोज को एक कदम आगे बढ़ाते हुए स्वयं शुरुआती सामग्री को बदल दिया। एक पूर्व-निर्मित वलय (ring) का उपयोग करने के बजाय जिसे एंजाइम को खोलना पड़ता, उन्होंने एंजाइम को 1-क्लोरो-3-फिनोक्सी-2-प्रोपेनॉल नामक एक सरल, सीधी-श्रृंखला वाला रसायन प्रदान किया। इसने एंजाइम को एक ही प्रतिक्रिया पात्र (reaction vessel) में दो-चरणीय प्रक्रिया करने की अनुमति दी। पहले, इसने सीधी श्रृंखला को एक वलय में परिवर्तित किया, और फिर तुरंत काम पूरा करने के लिए एक नाइट्रोजन-युक्त समूह जोड़ा। गतिज समाधान (kinetic resolution) के रूप में जानी जाने वाली यह क्रमिक प्रक्रिया, एक दोहरे फिल्टर की तरह कार्य करती है, जो हर चरण पर अशुद्धियों को हटा देती है। परिणाम और भी प्रभावशाली था: अंतिम उत्पाद 99 प्रतिशत की शुद्धता तक पहुँच गया, और वांछित सामग्री की प्राप्ति (yield) पिछले तरीके की तुलना में काफी बेहतर रही। शेष शुरुआती सामग्री भी अत्यधिक शुद्ध रूप में प्राप्त हुई, जिससे पूरी प्रक्रिया बहुत कुशल हो गई।

यह समझने के लिए कि यह नया एंजाइम इतना अच्छा क्यों काम कर रहा था, शोधकर्ताओं ने कंप्यूटर मॉडल के भीतर फिर से देखा। उन्होंने पाया कि उनके द्वारा किए गए दो परिवर्तनों ने प्रभावी रूप से उस सुरंग को नया आकार दिया जिससे कच्चे माल एंजाइम के हृदय तक पहुँचने के लिए यात्रा करते हैं। मूल एंजाइम में, सुरंग इतनी चौड़ी थी कि दोनों दर्पण-प्रतिबिंब रूप आसानी से गुजर सकें, जिससे उत्पादों का एक अस्त-व्यस्त मिश्रण बनता था। नए म्यूटेंट में, सुरंग अधिक प्रतिबंधात्मक हो गई। परिवर्तनों ने एक तंग फिट बनाया जिसने भौतिक रूप से अवांछित दर्पण-प्रतिबिंब रूप को सक्रिय स्थल से दूर धकेल दिया, जबकि सही रूप को पूरी तरह से बैठने की अनुमति दी। कंप्यूटर मॉडल ने दिखाया कि अवांछित रूप को एक ऐसी दूरी पर रखा गया था जहाँ वह प्रतिक्रिया नहीं कर सकता था, जबकि सही रूप ने एंजाइम के साथ मजबूत, स्थिर संबंध बनाए। इस भौतिक अवरोध और सटीक स्थिति ने एंजाइम की केवल एक आकार को चुनने की नई क्षमता की व्याख्या की।

यह कार्य यह प्रदर्शित करता है कि प्रोटीन में केवल दो स्थानों को सावधानीपूर्वक बदलकर, वैज्ञानिक एक एंजाइम के व्यवहार को नाटकीय रूप से बदल सकते हैं, जिससे एक अनाड़ी कार्यकर्ता एक सटीक उपकरण में बदल जाता है। इंजीनियर किया गया एंजाइम अब कई फार्मास्यूटिकल्स में उपयोग किए जाने वाले एक प्रमुख घटक के उत्पादन के लिए एक व्यवहार्य, हरित विकल्प प्रदान करता है। जहरीले रसायनों और कठोर परिस्थितियों से बचकर, यह जैविक दृष्टिकोण रासायनिक उद्योग में सतत विनिर्माण की बढ़ती आवश्यकता के अनुरूप है। यह अध्ययन पुष्टि करता है कि एंजाइम के आंतरिक सुरंगों के भौतिक आकार को समझना इसकी चयनात्मकता को नियंत्रित करने की कुंजी है, जो अन्य जटिल रासायनिक चुनौतियों के लिए बेहतर बायोकैटलिस्ट (biocatalysts) डिजाइन करने के भविष्य के प्रयासों के लिए एक स्पष्ट मार्ग प्रदान करता है।