A rapid single-nucleotide polymorphism genotyping method for mice using direct polymerase chain reaction of diluted crude lysates with HiDi DNA polymerase
यह अध्ययन चूहों के लिए एक तीव्र, दो-घंटे के जीनोटाइपिंग वर्कफ़्लो को स्थापित करता है जो डीएनए शुद्धिकरण या सेंगर अनुक्रमण (Sanger sequencing) की आवश्यकता के बिना, SNP के विश्वसनीय एलील-विशिष्ट PCR भेदभाव को प्राप्त करने के लिए 100-गुणा तनु (diluted) क्रूड HotSHOT लाइसेट्स को HiDi डीएनए पॉलीमरेज़ के साथ जोड़ता है।
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बायोमेडिकल अनुसंधान की दुनिया में, प्रयोगशाला चूहा एक भरोसेमंद साथी है। वैज्ञानिक इन जानवरों को उनके आनुवंशिक कोड में विशिष्ट परिवर्तन लाने के लिए पालते हैं, जिससे ऐसे मॉडल तैयार होते हैं जो हमें मानव रोगों को समझने और नए उपचारों का परीक्षण करने में मदद करते हैं। इसे प्रभावी ढंग से करने के लिए, शोधकर्ताओं को यह सटीक रूप से जानना आवश्यक है कि प्रत्येक चूहे के पास एक जीन का कौन सा संस्करण है। इस प्रक्रिया को जीनोटाइपिंग (genotyping) कहा जाता है, जो एक जानवर की पहचान की पुष्टि करने वाला एक नियमित चेकअप है। दशकों तक, इसे करने के मानक तरीके में ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा लेना, सावधानीपूर्वक लैब के भीतर डीएनए निकालना और फिर अनुक्रम (sequence) को पढ़ने के लिए इसे एक मशीन के माध्यम से चलाना शामिल था। हालांकि यह सटीक था, लेकिन यह तरीका धीमा था और इसके लिए महंगे उपकरणों और कुशल हैंडलिंग की आवश्यकता होती थी। आधुनिक उपकरणों के साथ वैज्ञानिकों द्वारा चूहों में उनके डीएनए में बहुत विशिष्ट, सूक्ष्म परिवर्तन बनाने की क्षमता ने, इन जानवरों की जांच करने के लिए एक तेज़ और सरल तरीके की आवश्यकता को अनिवार्य बना दिया है।
कनाज़ावा मेडिकल यूनिवर्सिटी, जापान के शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस बाधा को दूर करने के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण विकसित किया है। उन्होंने एक ऐसी विधि पर ध्यान केंद्रित किया जो समय लेने वाले डीएनए निष्कर्षण (extraction) चरण को पूरी तरह से छोड़ देती है। आनुवंशिक सामग्री को शुद्ध करने के बजाय, वे टूटे हुए चूहे की कोशिकाओं के एक कच्चे मिश्रण को लेते हैं और एक विशेष एंजाइम का उपयोग करते हैं जो यह चुनने में बहुत सख्त है कि किन आनुवंशिक अनुक्रमों की नकल करनी है। इस कच्चे मिश्रण को पतला करके और 'पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन' नामक प्रतिक्रिया के माध्यम से चलाकर, वे लगभग दो घंटे में चूहे की आनुवंशिक संरचना निर्धारित कर सकते हैं। परिणाम जेल (gel) पर सीधे पढ़ने के लिए पर्याप्त स्पष्ट हैं, जिससे पुष्टि के लिए आमतौर पर आवश्यक महंगी अनुक्रमण मशीनों की आवश्यकता समाप्त हो जाती है।
शोधकर्ताओं ने इस नए वर्कफ़्लो का परीक्षण उन चूहों पर किया जिनमें 'Gatad2b' नामक जीन में एक विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन था। इस परिवर्तन में आनुवंशिक कोड में एक एकल अक्षर का बदलाव शामिल है, जो कि 'सिंगल-न्यूक्लियोटाइड पॉलीमॉर्फिज्म' के रूप में जाना जाने वाला एक प्रकार का भिन्नता है। नमूनों को तैयार करने के लिए, उन्होंने प्रत्येक चूहे के कान के ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा लिया और उसे एक ट्यूब में एक शक्तिशाली क्षारीय (alkaline) घोल के साथ रखा। उन्होंने कोशिकाओं को तोड़ने के लिए मिश्रण को गर्म किया, जिससे एक कच्चा सूप तैयार हुआ जिसमें चूहे का डीएनए और अन्य कोशिकीय अवशेष शामिल थे। पिछले प्रयासों में, इस कच्चे सूप का सीधे प्रतिक्रिया में उपयोग करना अक्सर विफल हो जाता था क्योंकि अवशेषों में ऐसी पदार्थ होते थे जो नकल करने की प्रक्रिया में बाधा डालते थे। टीम ने पाया कि इस सूप को पानी के साथ केवल सौ गुना पतला करने से हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों को हटाने में मदद मिली, जिससे प्रतिक्रिया काम करने के लिए सक्षम हो गई।
उनकी सफलता की कुंजी एंजाइम का चयन था। उन्होंने 'HiDi' नामक एक विशेष डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग किया, जिसे प्राइमर (एक छोटा शुरुआती डीएनए टुकड़ा) के अंत को टेम्पलेट के साथ मिलाने के लिए अत्यंत सख्त बनाया गया है। यदि प्राइमर पूरी तरह से मेल नहीं खाता है, तो यह एंजाइम अनुक्रम की नकल करने से इनकार कर देता है। दो बहुत समान आनुवंशिक संस्करणों के बीच अंतर करने के लिए यह महत्वपूर्ण है। जब शोधकर्ताओं ने एक सामान्य, कम सख्त एंजाइम 'KOD FX Neo' का उसी तनु (diluted) नमूने के साथ उपयोग किया, तो इसने विसंगतियों को अनदेखा कर दिया और भ्रमित करने वाले, गैर-विशिष्ट परिणाम दिए। हालाँकि, HiDi एंजाइम ने केवल सही आनुवंशिक संस्करण को ही प्रवर्धित (amplify) किया, जिससे जेल पर एक साफ, स्पष्ट बैंड प्राप्त हुआ जिसने स्पष्ट रूप से पहचान की कि चूहे में मानक जीन था या संशोधित वाला।
टीम ने प्रतिक्रिया को कितनी बार दोहराया जाना चाहिए, इसकी संख्या को समायोजित करके प्रक्रिया को अनुकूलित किया, और सबसे मजबूत संकेत प्राप्त करने के लिए बिना किसी बैकग्राउंड शोर के {background noise} {38} चक्रों पर सहमति बनाई। जब उन्होंने इस विधि का परीक्षण नर और मादा चूहों पर किया, तो परिणाम 'सैंगर सीक्वेंसिंग' (Sanger sequencing) के साथ पूरी तरह मेल खाए, जो कि एक अधिक गहन और समय लेने वाला विश्लेषण है। ऊतक के नमूने लेने से लेकर जेल पर अंतिम परिणाम देखने तक की पूरी प्रक्रिया में लगभग दो घंटे लगे। यह पारंपरिक तरीकों की तुलना में एक महत्वपूर्ण सुधार है जिनमें डीएनए शुद्धिकरण और अनुक्रमण की आवश्यकता होती है, जिसमें बहुत अधिक समय लग सकता है और कई चरणों की आवश्यकता होती है।
हालाँकि, शोधकर्ताओं ने सावधानीपूर्वक नोट किया कि यह विधि प्रत्येक आनुवंशिक परीक्षण के लिए एक सार्वभौमिक समाधान नहीं है। जब उन्होंने इसी दृष्टिकोण को दूसरे जीन, 'Pex11b' पर आजमाया, जिसमें दो अक्षरों के बदलने वाला थोड़ा अलग प्रकार का परिवर्तन शामिल था, तो परिणाम मिश्रित रहे। विधि ने उन चूहों की सफलतापूर्वक पहचान की जिनमें प्रत्येक जीन संस्करण की एक प्रति थी, लेकिन यह उन चूहों के बीच विश्वसनीय रूप से अंतर करने में संघर्ष करती रही जिनमें एक ही संस्करण की दो प्रतियां थीं। यह सुझाव देता है कि जबकि यह तकनीक कुछ विशिष्ट आनुवंशिक लक्ष्यों के लिए अच्छी तरह से काम करती है, इसकी सफलता काफी हद तक परीक्षण किए जा रहे जीन के विशिष्ट अनुक्रम और प्राइमरों के डिजाइन पर निर्भर करती है।
अध्ययन यह निष्कर्ष निकालता है कि यह तीव्र, प्रत्यक्ष पीसीआर (PCR) विधि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की बड़ी कॉलोनियों के प्रबंधन के लिए एक व्यावहारिक और लागत प्रभावी उपकरण प्रदान करती है, बशर्ते कि विशिष्ट परीक्षण पहले मान्य (validate) कर लिया जाए। डीएनए शुद्धिकरण और नियमित अनुक्रमण की आवश्यकता को हटाकर, प्रयोगशालाएं इस बारे में तेजी से निर्णय ले सकती हैं कि किन जानवरों का प्रजनन करना है और किन्हें प्रयोगों के लिए उपयोग करना है। यह दृष्टिकोण एक सरल संतुलन पर निर्भर करता है: कच्चे ऊतक के नमूने को रोकने वाले तत्वों (inhibitors) को हटाने के लिए पर्याप्त रूप से पतला करना, जबकि पता लगाने के लिए पर्याप्त डीएनए बनाए रखना, और एक ऐसे एंजाइम का उपयोग करना जो एक पूर्ण मिलान और एक एकल अक्षर की त्रुटि के बीच अंतर करने के लिए पर्याप्त सख्त हो। Gatad2b जीन के लिए, यह संतुलन पाया गया, जिसने इन महत्वपूर्ण अनुसंधान जानवरों की आनुवंशिक पहचान को समझने के लिए एक तेज़ मार्ग प्रदान किया।
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