A Universal Prime Editing Strategy for Locus-Specific Correction of Multiple Splice-Site Mutations
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि एक एकल डीएनए प्राइम एडिटिंग सिस्टम हीमोफिलिया-जुड़े जीनों में कई विशिष्ट 5′ स्प्लिस-साइट उत्परिवर्तनों को एक साथ ठीक कर सकता है, जो कार्यात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति और जमावट गतिविधि (कोगुलांट एक्टिविटी) को सफलतापूर्वक बहाल करता है।
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मानव शरीर उन प्रोटीनों को बनाने के लिए निर्देशों के एक जटिल सेट पर निर्भर करता है जो रक्त के प्रवाह को सही तरह से बनाए रखते हैं। ये निर्देश डीएनए (DNA) में संग्रहीत होते हैं, लेकिन किसी प्रोटीन को बनाने से पहले, कोशिका को डीएनए की एक कार्यशील प्रतिरूप (template) के रूप में नकल करनी होती है जिसे आरएनए (RNA) कहा जाता है। इस आरएनए प्रति में अक्सर अतिरिक्त भाग होते हैं जिन्हें बाहर निकालना आवश्यक होता है और शेष टुकड़ों को सही क्रम में चिपकाया जाना चाहिए, यह एक प्रक्रिया है जिसे स्प्लिसिंग (splicing) कहा जाता है। यदि कैंची अपना निशान चूक जाए या गलत टुकड़ों को जोड़ दे, तो अंतिम प्रोटीन टूट सकता है या पूरी तरह से गायब हो सकता है। इस प्रकार की त्रुटि आनुवंशिक रोगों का एक सामान्य कारण है, जिसमें हीमोफिलिया भी शामिल है, एक ऐसी स्थिति जहाँ रक्त ठीक से थक्का नहीं बना पाता है। दशकों से, वैज्ञानिक इन विशिष्ट कटने वाली त्रुटियों को ठीक करने के लिए संघर्ष कर रहे थे क्योंकि निर्देश अक्सर डीएनए के भीतर गहराई में दबे होते हैं, और जीन को संपादित करने वाले पिछले उपकरण या तो बहुत भारी हाथों वाले थे, जिससे आस-पास के कोड को नुकसान पहुँचने का जोखिम था, या बहुत विशिष्ट थे, जिसके लिए प्रत्येक रोगी के लिए एक अद्वितीय समाधान की आवश्यकता थी।
फेरारा विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं ने अब 'प्राइम एडिटिंग' (prime editing) नामक एक तकनीक का उपयोग करके इन टूटे हुए निर्देशों को ठीक करने का एक नया तरीका प्रदर्शित किया है। डीएनए स्ट्रैंड को दो भागों में काटने के बजाय, जो खतरनाक गलतियाँ पैदा कर सकता है, यह विधि एक सटीक वर्ड प्रोसेसर की तरह कार्य करती है जो एक विशिष्ट टाइपो (typo) को ढूंढती है और बिना पन्ने को फाड़े उसे फिर से लिख देती है। शोधकर्ताओं ने उन उत्परिवर्तनों (mutations) के एक समूह पर ध्यान केंद्रित किया जो स्प्लिसिंग के "स्टार्ट" सिग्नल को बाधित करते हैं, जिससे कोशिका आनुवंशिक कोड के आवश्यक अनुभागों को छोड़ देती है। उन्होंने परीक्षण किया कि क्या एक एकल, सावधानीपूर्वक डिज़ाइन किया गया गाइड, हीमोफिलिया ए और बी के लिए जिम्मेदार जीन में विभिन्न प्रकार की त्रुटियों को ठीक कर सकता है। उनका कार्य यह दर्शाता है कि एक सार्वभौमिक उपकरण का उपयोग करके एक ही स्थान पर कई अलग-अलग उत्परिवर्तनों को सुधारा जा सकता है, जिससे कार्यात्मक क्लॉटिंग प्रोटीन का उत्पादन बहाल हो जाता है।
शोधकर्ताओं ने मानव कोशिकाओं के भीतर, जिन्हें एक डिश में उगाया गया था, समस्या का एक मॉडल बनाकर शुरुआत की। उन्होंने क्लॉटिंग कारकों के आनुवंशिक अनुक्रमों को डाला, लेकिन उनमें विशिष्ट त्रुटियां थीं जो गंभीर हीमोफिलिया वाले रोगियों में पाए जाने वाले उत्परिवर्तनों की नकल करती हैं। इन कोशिकाओं में, स्प्लिसिंग मशीनरी पूरी तरह से विफल हो गई, आवश्यक आनुवंशिक अनुभाग को छोड़ दिया और कोई भी कार्यशील प्रोटीन नहीं बनाया। टीम ने प्राइम एडिटिंग सिस्टम पेश किया, जो एक आणविक खोज इंजन और एक रिपेयर टेम्पलेट से बना है। उन्होंने एक एकल गाइड आरएनए (guide RNA) डिज़ाइन किया जो उस विशिष्ट स्थान को लक्षित कर सके जहाँ त्रुटियां हुई थीं और सही आनुवंशिक कोड के संस्करण को ले जा सके। जब सिस्टम ने लक्ष्य को पाया, तो उसने डीएनए में एक छोटा सा कट (nick) लगाया और टेम्पलेट का उपयोग करके गलती को ओवरराइट कर दिया, प्रभावी रूप से निर्देश को फिर से लिखा ताकि कोशिका उस अनुभाग को फिर से पहचान सके।
परिणामों ने दिखाया कि यह दृष्टिकोण विभिन्न उत्परिवर्तनों की एक श्रृंखला में काम करता है। हीमोफिलिया ए के जीन में त्रुटियों वाले सेल्स में, उपचार ने लगभग 7 प्रतिशत संदेशों में सही स्प्लिसिंग पैटर्न को बहाल किया। हीमोफिलिया बी के लिए, सुधार कुछ मामलों में और भी अधिक स्पष्ट था, जहाँ 50 प्रतिशत तक संदेशों को सुधारा गया। हालांकि ये संख्याएँ छोटी लग सकती हैं, शोधकर्ताओं ने उल्लेख किया कि इस बीमारी के लिए आंशिक सुधार भी महत्वपूर्ण है। हीमोफिलिया में, क्लॉटिंग फैक्टर के स्तर को शून्य से केवल कुछ प्रतिशत तक बढ़ाना एक गंभीर स्थिति को, जहाँ रक्त स्वतः बह जाता है, एक हल्की स्थिति में बदल सकता है जहाँ रक्त केवल चोट लगने के बाद बहता है। सुधारे गए सेल्स ने लापता क्लॉटिंग प्रोटीन का उत्पादन शुरू कर दिया, और ये प्रोटीन न केवल मौजूद थे बल्कि कार्यात्मक भी थे, जो प्रयोगशाला परीक्षणों में रक्त को थक्का जमाने में मदद करने में सक्षम थे।
इन निष्कर्षों को पुख्ता करने के लिए, टीम ने स्थिर सेल लाइन्स बनाईं जिनमें आनुवंशिक निर्देश स्थायी रूप से मौजूद थे, जो एक दीर्घकालिक उपचार परिदृश्य की नकल करते हैं। इन कोशिकाओं में, प्राइम एडिटिंग सिस्टम ने फिर से क्लॉटिंग कारकों के उत्पादन को सफलतापूर्वक बहाल किया। सुधारा गया कार्यात्मक प्रोटीन का स्तर स्वस्थ व्यक्तियों के मुकाबले 10 से 27 प्रतिशत के बीच पहुँच गया। महत्वपूर्ण रूप से, शोधकर्ताओं ने सुधारे गए आनुवंशिक संदेश और उत्पादित कार्यशील प्रोटीन की मात्रा के बीच एक सीधा संबंध पाया। यह निरंतरता बताती है कि मरम्मत ठीक उसी तरह से हो रही थी जैसा कि इरादा था, न कि किसी यादृच्छिक या अस्थायी सुधार के माध्यम से। अध्ययन ने यह भी रेखांकित किया कि उपयोग किए गए एडिटिंग टूल का विशिष्ट संस्करण मायने रखता था; कुछ उत्परिवर्तन ऐसे क्षेत्रों में स्थित थे जहाँ अधिक लचीले संस्करण की आवश्यकता थी, और इन उन्नत उपकरणों के उपयोग ने सफलता दर में सुधार किया।
अध्ययन निष्कर्ष निकालता है कि यह रणनीति उन रोगियों के एक बड़े समूह के लिए एक सार्वभौमिक उपचार की दिशा में एक संभावित मार्ग प्रदान करती है जिन्हें वर्तमान में व्यक्तिगत उपचारों की आवश्यकता होती है। एक ही गाइड आरएनए का उपयोग करके एक ही जेनेटिक लोकेशन पर कई अलग-अलग त्रुटियों को ठीक करने के माध्यम से, यह दृष्टिकोण स्प्लिसिंग-संबंधित विकारों के इलाज के विकास को सरल बना सकता है। शोधकर्ता जोर देते हैं कि हालांकि यह कार्य कोशिकाओं में किया गया था और अभी तक मनुष्यों में नहीं, लेकिन कार्यात्मक प्रोटीन के स्तर को बहाल करने की क्षमता, जो बीमारी की गंभीरता को काफी कम कर सकती है, एक आशाजनक कदम है। यह विधि डीएनए को आधा काटने से जुड़े जोखिमों से बचती है और एक ही प्रमाणित उत्पाद के साथ रोगियों के एक व्यापक समूह का इलाज करने का एक तरीका प्रदान करती है, जो इस क्षेत्र को इन आनुवंशिक स्थितियों के निश्चित इलाज के करीब ले जाती है।
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