Knobs-into-Holes Engineering Enables Assembly of Bispecific Anti-HER2/Anti-HER3 Antibodies in Transient Plant Expression System

कैंसर का उपचार अक्सर एंटीबॉडी पर निर्भर करता है, जो कि Y-आकार के प्रोटीन हैं और अत्यधिक विशिष्ट चाबियों की तरह कार्य करते हैं। ये चाबियाँ इस तरह बनाई जाती हैं कि वे कैंसर कोशिकाओं की सतह पर मौजूद तालों में फिट हो सकें, जिससे उन संकेतों को रोका जा सके जो ट्यूमर को बढ़ने या जीवित रहने के लिए कहते हैं। वर्षों से, वैज्ञानिक केवल एक प्रकार के ताले को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी बनाने पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। हालाँकि, कैंसर कोशिकाएं चतुर होती हैं; वे अक्सर एक एकल अवरोध को दरकिनार करने के तरीके खोज लेती हैं, जिससे उपचार विफल हो जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए, शोधकर्ता अब "बाइसैस्पेसिफिक" (bispecific) एंटीबॉडी बनाने की कोशिश कर रहे हैं। ये इंजीनियर किए गए अणु हैं जो एक ही समय में दो अलग-अलग तालों को पकड़ सकते हैं, जिससे प्रभावी रूप से कैंसर कोशिका की संचार लाइनों को दो स्थानों पर एक साथ जाम किया जा सके। हालांकि यह दृष्टिकोण बहुत आशाजनक है, लेकिन इन जटिल अणुओं को बनाना कठिन है। पारंपरिक विनिर्माण में, एंटीबॉडी के हिस्से अक्सर आपस में मिल जाते हैं, गलत संयोजनों में जुड़ जाते हैं और बेकार उत्पाद बना देते हैं।

चंग-आंग विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं की एक टीम और उनके सहयोगियों ने पौधों का उपयोग करके इन दोहरे-लक्ष्य वाले चाबियों को बनाने का एक नया तरीका खोजा है। उन्होंने कुछ विशेष स्तन कैंसर में पाए जाने वाले दो विशिष्ट तालों पर ध्यान केंद्रित किया, जिन्हें HER2 और HER3 के रूप में जाना जाता है। जब ये दो ताले मिलकर काम करते हैं, तो वे एक शक्तिशाली संकेत भेजते हैं जो कैंसर को बढ़ने और मानक उपचारों का विरोध करने में मदद करता है। वैज्ञानिक एक ऐसा एकल एंटीबॉडी बनाना चाहते थे जो HER2 और HER3 दोनों से एक साथ जुड़ सके। इसे करने के लिए, उन्होंने "नॉब्स-इंटू-होल्स" (Knobs-into-Holes) इंजीनियरिंग नामक पद्धति का उपयोग किया। कल्पना कीजिए कि आप दो पहेली के टुकड़ों (puzzle pieces) को एक साथ जोड़ने की कोशिश कर रहे हैं; यदि दोनों टुकड़ों का आकार समान है, तो वे अपने इच्छित साथी के बजाय अपने ही किसी दूसरे टुकड़े के साथ जुड़ सकते हैं। शोधकर्ताओं ने एंटीबॉडी के हिस्सों को इस तरह संशोधित किया कि एक तरफ एक उभरा हुआ "नॉब" (knob) था और दूसरी तरफ एक मिलान करने वाला "होल" (hole) था। यह डिज़ाइन दो अलग-अलग एंटीबॉडी श्रृंखलाओं को सही ढंग से जुड़ने के लिए मजबूर करता है, जिससे वे अपने ही प्रकार के अन्य हिस्सों के साथ नहीं उलझते।

टीम ने इन संशोधित एंटीबॉडी भागों के आनुवंशिक निर्देशों को Agrobacterium नामक एक सामान्य मृदा जीवाणु (soil bacterium) में पेश किया। इसके बाद, उन्होंने इस जीवाणु का उपयोग करके निर्देशों को Nicotiana benthamiana नामक पौधे की पत्तियों में सीधे पहुँचाया, जो तंबाकू के पौधे का एक संबंधी है और अनुसंधान में अक्सर उपयोग किया जाता है। "ट्रांसिएंट एक्सप्रेशन" (transient expression) के रूप में जानी जाने वाली यह प्रक्रिया, पौधे की कोशिकाओं को अस्थायी रूप से छोटे कारखानों के रूप में कार्य करने देती है, जो डीएनए को पढ़ती हैं और प्रोटीन का उत्पादन करती हैं। शोधकर्ताओं ने दो एंटीबॉडी निर्देशों के विभिन्न मिश्रणों का परीक्षण किया ताकि यह देखा जा सके कि किस अनुपात से सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त होते हैं। उन्होंने पाया कि जब उन्होंने निर्देशों को एक विशिष्ट अनुपात में मिलाया, तो पौधे की कोशिकाओं ने जटिल, दोहरे-लक्ष्य वाले एंटीबॉडी को सफलतापूर्वक असेंबल किया। इंजेक्शन के सातवें दिन तक, प्रोटीन का उत्पादन अपने चरम पर था।

यह पुष्टि करने के लिए कि पौधे ने वास्तव में सही एंटीबॉडी बनाया है, वैज्ञानिकों ने पत्तियों से प्रोटीन निकाला और उनका विश्लेषण किया। उन्होंने प्रोटीन को आकार के आधार पर अलग करने वाली एक तकनीक का उपयोग किया, जिससे पता चला कि पौधे ने एक ऐसा अणु बनाया जिसका वजन एक सही रूप से जुड़े एंटीबॉडी के अपेक्षित वजन के बिल्कुल बराबर था। यह अणु एक एकल एंटीबॉडी भाग से भारी था लेकिन दो अलग-अलग एंटीबॉडी के एक साथ जुड़े होने से हल्का था, जिससे सिद्ध हुआ कि दो अलग-अलग श्रृंखलाओं ने मिलकर एक एकल, एकीकृत संरचना बनाई है। टीम ने एक कॉलम का उपयोग करके पौधे के रस से एंटीबॉडी को शुद्ध किया जो इस विशिष्ट प्रकार के प्रोटीन के लिए चुंबक की तरह कार्य करता है। अंतिम उत्पाद स्वच्छ और परीक्षण के लिए तैयार था।

इसके बाद शोधकर्ताओं ने जांच की कि क्या उनके पौधे से बने एंटीबॉडी वास्तव में अपना काम कर सकते हैं। उन्होंने एंटीबॉडी को HER2 प्रोटीन और HER3 प्रोटीन वाले नमूनों के संपर्क में रखा। परीक्षणों ने दिखाया कि एंटीबॉडी ने सफलतापूर्वक दोनों लक्ष्यों को पकड़ा। यह HER3 से मजबूती से जुड़ा और HER2 को थामे रहा, जिससे पुष्टि हुई कि जटिल इंजीनियरिंग के बावजूद अणु ने दोनों लक्ष्यों को पहचानने की अपनी क्षमता बनाए रखी। यह समझने के लिए कि एंटीबॉडी इतनी अच्छी तरह से क्यों टिका रहा, टीम ने अणु की संरचना का मॉडल बनाने के लिए कंप्यूटर सिमुलेशन का उपयोग किया। इन सिमुलेशन ने दिखाया कि "नॉब" और "होल" डिज़ाइन ने एक स्थिर कनेक्शन बनाया जो अनमॉडिफाइड (unmodified) भागों द्वारा बनाए गए कनेक्शन की तुलना में बहुत अधिक मजबूत था। कंप्यूटर मॉडल ने सुझाव दिया कि यह विशिष्ट युग्मन ऊर्जावान रूप से अनुकूल (energetically favorable) था, जिसका अर्थ है कि दोनों हिस्से स्वाभाविक रूप से उसी तरह एक साथ रहना चाहते थे जैसा कि वैज्ञानिकों ने चाहा था।

यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि जटिल, दो-इन-एक एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए पौधों का उपयोग कुशल कारखानों के रूप में किया जा सकता है। "नॉब्स-इंटू-होल्स" रणनीति को पौधे-आधारित उत्पादन के साथ जोड़कर, शोधकर्ता एंटीबॉडी के हिस्सों के गलत तरीके से मिलने की सामान्य समस्या को दूर करने में सफल रहे। परिणाम बताते हैं कि यह विधि नए कैंसर उपचारों के निर्माण के लिए एक व्यवहार्य मार्ग हो सकती है जो पशु कोशिकाओं में बनाए गए उपचारों की तुलना में अधिक प्रभावी और संभावित रूप से सस्ते हो सकते हैं। यह कार्य पुष्टि करता है कि पौधे की प्रणाली एक बाइसैस्पेसिफिक एंटीबॉडी को असेंबल करने के जटिल कार्य को संभालने में सक्षम है, जो भविष्य में पौधे-आधारित दवाओं के विकास के द्वार खोलता है।