Cross-Platform Evaluation of Long-Read Sequencing for DNA Methylation and Portability of Methylation Predictors
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि जबकि लॉन्ग-रीड सीक्वेंसिंग प्रौद्योगिकियां (ONT और PacBio) व्यापक मिथिलोम कवरेज प्रदान करती हैं और बड़े पैमाने के मिथाइलेशन प्रेडिक्टर्स की पोर्टेबिलिटी का समर्थन करती हैं, बढ़ी हुई सीक्वेंसिंग गहराई, अंशांकन (कैलिब्रेशन) और प्लेटफॉर्म-विशिष्ट सत्यापन के बिना, व्यक्तिगत CpG साइटों पर उनकी वर्तमान क्रॉस-प्लेटफॉर्म सहमति इलुमिना EPIC एरे के प्रत्यक्ष प्रतिस्थापन के लिए अपर्याप्त बनी हुई है।
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मानव कोशिकाओं में निर्देशों की एक छिपी हुई परत होती है जो जेनेटिक कोड के ऊपर स्थित होती है, जो एक डिमर स्विच की तरह काम करती है जो डीएनए के अक्षरों को बदले बिना जीन को कम या ज्यादा करती है। यह परत, जिसे डीएनए मिथाइलेशन (DNA methylation) के रूप में जाना जाता है, एक रासायनिक टैग है जो जीनोम के विशिष्ट स्थानों पर जुड़ जाता है, जिससे यह निर्धारित करने में मदद मिलती है कि एक कोशिका कैसे व्यवहार करती है, वह कितनी पुरानी दिखती है, और वह स्वस्थ है या बीमार। दशकों तक, वैज्ञानिक इन टैग्स को पढ़ने के लिए एक मानक प्रयोगशाला उपकरण पर निर्भर रहे हैं, एक ऐसी विधि जो अच्छी तरह से काम करती है लेकिन उन लाखों स्थानों का केवल एक बहुत छोटा हिस्सा ही जांच पाती है जहाँ ये टैग दिखाई दे सकते हैं। यह एक विशाल घर के केवल कुछ खिड़कियों को देखकर मौसम को समझने की कोशिश करने जैसा है। हाल ही में, नई तकनीकें उभरी हैं जो डीएनए नमूने को नष्ट किए बिना पूरे जीनोम में इन टैग्स को पढ़ने का वादा करती हैं, जो एक बहुत व्यापक दृश्य प्रदान करती हैं। हालाँकि, इससे पहले कि वैज्ञानिक बड़े अध्ययनों के लिए इन नए उपकरणों पर भरोसा कर सकें, उन्हें यह जानने की आवश्यकता है कि क्या विभिन्न मशीनें एक-दूसरे के साथ सहमत हैं और क्या डेटा की व्याख्या करने के पुराने नियम अभी भी लागू होते हैं।
शोधकर्ताओं की एक टीम ने इन नई लॉन्ग-रीड सीक्वेंसिंग (long-read sequencing) मशीनों का परीक्षण करने के लिए, जो दो अलग-अलग कंपनियों की हैं, स्थापित मानक के विरुद्ध परीक्षण करने का लक्ष्य रखा। उन्होंने लोगों के दो बड़े समूहों से रक्त के नमूने लिए और उन्हें तीन अलग-अलग प्रणालियों के माध्यम से चलाया: पुराना मानक तरीका, और दो नई लॉन्ग-रीड मशीनें। लक्ष्य यह देखना था कि क्या नई मशीनें उसी जानकारी को कैप्चर कर सकती हैं जो पुरानी मशीन कर सकती है, और क्या नई मशीनें आपस में सहमत हैं। शोधकर्ताओं ने पाया कि दोनों नई मशीनें लगभग पूरे जीनोम को स्कैन करने में सक्षम थीं, जिसमें मिथाइलेशन टैग मौजूद हो सकते थे ऐसे लगभग दो करोड़ अस्सी लाख स्थान मिले, जो मानक पद्धति की तुलना में एक बड़ा सुधार है जो केवल कुछ लाख स्थानों को ही देखती है। यह व्यापक कवरेज एक महत्वपूर्ण कदम है, जिससे वैज्ञानिकों को जीनोम के उन क्षेत्रों को देखने की अनुमति मिलती है जो बड़े पैमाने के अध्ययनों के लिए पहले अदृश्य थे।
हालाँकि, जब शोधकर्ताओं ने एक ही व्यक्ति के एक ही स्थान के लिए मशीनों द्वारा उत्पन्न विशिष्ट संख्याओं की तुलना की, तो सहमति पूर्ण नहीं थी। जबकि मशीनें आम तौर पर एक ही पैटर्न देखती थीं, व्यक्तिगत स्थानों के लिए सटीक माप अक्सर भिन्न होते थे। शोधकर्ताओं ने पाया कि प्रत्येक स्थान के लिए एकत्र किया गया डेटा की मात्रा, जिसे 'रीड डेप्थ' (read depth) कहा जाता है, एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। जब उन्होंने अनुकरण किया कि क्या होगा यदि वे अधिक डेटा एकत्र करते, तो उन्होंने पाया कि एक मशीन को पुराने मानक तरीके की विश्वसनीयता से मेल खाने के लिए प्रत्येक स्थान को लगभग पचास से साठ बार पढ़ने की आवश्यकता होगी। उनके वास्तविक प्रयोगों में, एक नई मशीन ने पर्याप्त डेटा एकत्र किया जिससे वह इस स्तर की विश्वसनीयता के करीब पहुँच गई, जबकि दूसरी मशीन ने थोड़ा कम डेटा एकत्र किया। यह सुझाव देता है कि नए उपकरण शक्तिशाली हैं, लेकिन वर्तमान में उन्हें पूरी तरह से भरोसेमंद होने के लिए पर्याप्त डेटा बिंदु एकत्र करने हेतु पर्याप्त तीव्रता के साथ चलाने की आवश्यकता है।
अध्ययन ने यह भी परीक्षण किया कि क्या जैविक आयु या रोग के जोखिम जैसी चीजों की भविष्यवाणी करने के लिए वैज्ञानिक उपयोग में आने वाले गणितीय सूत्र सीधे नए डेटा के साथ उपयोग किए जा सकते हैं। ये सूत्र व्यंजनों (recipes) की तरह हैं जो स्कोर देने के लिए विशिष्ट स्थानों के मिथाइलेशन स्तरों को जोड़ते हैं। शोधकर्ताओं ने पाया कि व्यंजन का आकार बहुत मायने रखता था। वे सूत्र जो हजारों स्थानों का उपयोग करते थे, विभिन्न मशीनों के बीच अच्छी तरह से काम करते थे, और समान परिणाम देते थे। इसके विपरीत, वे सूत्र जो केवल कुछ सौ स्थानों पर निर्भर थे, अक्सर अलग-अलग मशीनों के आधार पर बहुत अलग उत्तर देते थे। यह इंगित करता है कि जबकि नई मशीनें जटिल भविष्यवाणियों का समर्थन कर सकती हैं, पुरानी तकनीक के लिए विकसित सरल, विरल (sparse) सूत्र बिना किसी समायोजन के सीधे स्थानांतरित नहीं हो सकते हैं।
अंत में, टीम ने कई लोगों के नमूनों को मशीनों में चलाने से पहले उन्हें आपस में मिलाकर पैसे बचाने की रणनीति की जांच की। उन्हें उम्मीद थी कि इससे वे बड़े समूहों का अध्ययन सस्ते में कर पाएंगे। परिणामों ने दिखाया कि हालांकि यह दृष्टिकोण समूह की एक सामान्य समझ प्राप्त करने के लिए काम करता था, लेकिन यह प्रत्येक व्यक्तिगत स्थान के सटीक माप के लिए पर्याप्त डेटा प्रदान नहीं करता था। मिश्रण ने डेटा को इतना पतला कर दिया कि जीनोम के विशिष्ट स्थानों के लिए सटीक रीडिंग प्राप्त करना असंभव हो गया। फलस्वरूप, शोधकर्ताओं ने निष्कर्ष निकाला कि जबकि पूलिंग (pooling) व्यापक सारांशों के लिए काम कर सकती है, यह उन अध्ययनों के लिए उपयुक्त नहीं है जिनमें प्रत्येक व्यक्ति के लिए सटीक माप की आवश्यकता होती है।
यह कार्य बताता है कि लॉन्ग-रीड सीक्वेंसिंग एपिजीनोम (epigenome) के अध्ययन के लिए एक आशाजनक भविष्य है, जो एक ऐसा दृश्य प्रदान करती है जो पहले असंभव था। फिर भी, इसके निष्कर्ष एक चेतावनी के रूप में भी कार्य करते हैं कि ये उपकरण बिना सावधानीपूर्वक अंशांकन (calibration) के पुराने तरीकों के प्रत्यक्ष विकल्प नहीं हैं। इनका प्रभावी ढंग से उपयोग करने के लिए, वैज्ञानिकों को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि वे मशीनों के बीच प्राकृतिक विविधताओं को दूर करने के लिए पर्याप्त डेटा एकत्र कर रहे हैं और उन्हें अपने भविष्यवाणी मॉडल को मान्य करना चाहिए ताकि वे नई तकनीक के साथ काम कर सकें। आगे का रास्ता इन नए उपकरणों की अविश्वसनीय व्यापकता और सटीक वैज्ञानिक खोजों के लिए आवश्यक सटीकता के बीच संतुलन बनाने की ओर अग्रसर है।
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