Impact of disruption methods on high molecular weight DNA extracted from archived frozen tissues
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि अनुकूलित टिश्यूलाइसर (TissueLyser) होमोजेनाइजेशन, विशेष रूप से ATL बफर का उपयोग करते समय, आर्काइव्ड फ्रोजन ऊतकों से उच्च आणविक भार वाले डीएनए (DNA) को निकालने के लिए एक मानकीकृत और कुशल विधि प्रदान करता है, जो तरल नाइट्रोजन-आधारित व्यवधान विधियों की तुलना में विभिन्न प्रकार के ऊतकों में बेहतर उपज और निरंतरता प्रदान करता है।
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आधुनिक बायोबैंकों के जमे हुए तहखानों की गहराइयों में हजारों ऊतक (टिश्यू) नमूने मौजूद हैं, जिन्हें अतीत के टाइम कैप्सूल की तरह लिक्विड नाइट्रोजन में संरक्षित किया गया है। ये केवल जमे हुए मांस के टुकड़े नहीं हैं; ये आनुवंशिक जानकारी के भंडार हैं, जिनमें मानव स्वास्थ्य और रोग के ब्लूप्रिंट सुरक्षित हैं। जीनोमिक्स के अत्याधुनिक क्षेत्र में काम करने वाले वैज्ञानिकों के लिए, विशेष रूप से वे जो उन्नत अनुक्रमण (सीक्वेंसिंग) तकनीकों का उपयोग करते हैं जो एक ही बार में जेनेटिक कोड के लंबे धागों को पढ़ सकते हैं, इस डीएनए की गुणवत्ता ही सब कुछ है। यदि जेनेटिक धागे टूटे हुए या बहुत छोटे हैं, तो सबसे परिष्कृत मशीनें भी उन्हें ठीक से नहीं पढ़ सकतीं। हालाँकि, चुनौती केवल इन नमूनों को संग्रहीत करने में नहीं है, बल्कि उन्हें इस तरह से तोड़ने में है कि उनके भीतर के नाजुक जेनेटिक धागों को बिना तोड़े उनके रहस्यों को मुक्त किया जा सके। जमे हुए ऊतक के एक ठोस टुकड़े को कोशिकाओं के तरल सूप में बदलने की प्रक्रिया को 'डिस्ट्रप्शन' (विघटन) कहा जाता है, और इस कार्य के लिए चुना गया तरीका एक सफल प्रयोग और एक बर्बाद प्रयोग के बीच का अंतर तय कर सकता है।
वुहान यूनिवर्सिटी के एक शोधकर्ता ने इसी विशिष्ट पहेली को सुलझाने का बीड़ा उठाया। वे जानना चाहते थे कि जमे हुए ऊतकों को तोड़ने का कौन सा तरीका उच्च गुणवत्ता वाले, लंबे डीएनए धागों को निकालने के लिए सर्वोत्तम परिणाम देगा। उन्होंने अपने शोध की शुरुआत खरगोश के यकृत (लीवर) ऊतक से की, जो ऐसे अध्ययनों के लिए एक मानक मॉडल है, और तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों का परीक्षण किया। पहला एक पारंपरिक, मैनुअल तरीका था जहाँ शोधकर्ताओं ने लिक्विड नाइट्रोजन में 'पेस्टल और मोर्टर' का उपयोग करके ऊतक को मोटे टुकड़ों में कुचला। दूसरा उसी तकनीक का अधिक आक्रामक संस्करण था, जिसमें ऊतक को महीन पाउडर में पीस दिया गया। तीसरे दृष्टिकोण में 'टिश्यू लाइसर' नामक मशीन का उपयोग किया गया, जो एक ट्यूब के भीतर ऊतक को हिलाने और कुचलने के लिए छोटी मोतियों (बीड्स) का उपयोग करती है, यह विधि अपनी गति और एक साथ कई नमलों को संभालने की क्षमता के कारण तेजी से लोकप्रिय हो रही है।
इन प्रारंभिक परीक्षणों के परिणामों ने एक स्पष्ट समझौता (ट्रेड-ऑफ) प्रकट किया। जिस विधि ने सबसे महीन पाउडर बनाया, यानी मैनुअल ग्राइंडिंग, उसने वास्तव में सबसे कम डीएनए दिया और सबसे अधिक टूटे हुए, खंडित धागे उत्पन्न किए। ऐसा लगा कि ऊतक को महीन धूल में बदलने के लिए आवश्यक तीव्र भौतिक बल ने जेनेटिक सामग्री को भी तोड़ दिया था। मैनुअल स्मैशिंग विधि, जिसने ऊतक को बड़े, मोटे टुकड़ों में छोड़ा, डीएनए को लंबा और अखंड बनाए रखने में बेहतर रही, लेकिन इसने उतनी डीएनए मुक्त नहीं की जितनी शोधकर्ता को उम्मीद थी। मशीन-आधारित शेकिंग विधि, जब सादे पानी के साथ उपयोग की गई, तो उसने सबसे अधिक डीएनए मुक्त किया और वह बहुत साफ था, लेकिन इसके द्वारा उत्पादित धागे मैनुअल स्मैशिंग की तुलना में छोटे थे।
शोधकर्ता को तब एहसास हुआ कि जिस तरल में ऊतक को हिलाया जा रहा है, वह केवल हिलाने (शेकिंग) जितना ही महत्वपूर्ण हो सकता है। उन्होंने दो अलग-अलग तरल पदार्थों का उपयोग करके मशीन का परीक्षण किया: एक मानक नमक का घोल जिसे 'फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन' (PBS) कहा जाता है, और एक विशेष 'लाइसिस बफर' जिसे कोशिकाओं को तोड़ने के लिए डिज़ाइन किया गया है। जब उन्होंने नमक के घोल का उपयोग किया, तो मशीन ने उल्लेखनीय रूप से लंबे और अखंड डीएनए धागे उत्पन्न किए, जो मैनुअल विधियों के सर्वोत्तम परिणामों के बराबर थे, हालांकि कुल मात्रा थोड़ी कम थी। हालाँकि, जब उन्होंने विशेष लाइसिस बफर पर स्विच किया, तो मशीन ने भारी मात्रा में डीएनए मुक्त किया, जो किसी भी अन्य विधि से कहीं अधिक था, लेकिन धागे काफी छोटे थे। ऐसा प्रतीत हुआ कि ट्यूब के भीतर का रासायनिक वातावरण या तो डीएनए को टूटने से बचा रहा था या फिर, लाइसिस बफर के मामले में, इसे मुक्त करना आसान बना रहा था लेकिन साथ ही शेकिंग के यांत्रिक बलों के प्रति अधिक संवेदनशील भी बना रहा था।
एक आदर्श संतुलन खोजने के लिए, शोधकर्ता ने मशीन की सेटिंग्स को सूक्ष्मता से सुधारा। उन्होंने पाया कि लाइसिस बफर का उपयोग करते समय ऊतक को अधिक धीरे से, धीमी गति से हिलाने से डीएनए धागों की लंबाई को बनाए रखने में मदद मिली, हालांकि इससे कुल डीएनए कम निकला। इसके विपरीत, नमक के घोल में ऊतक को अधिक समय तक हिलाने से परिणामों में कोई सुधार नहीं हुआ, जिससे पता चला कि प्रारंभिक संक्षिप्त झटके के बाद ऊतक पहले से ही पूरी तरह से टूट चुका था। शोधकर्ता ने अपने सबसे आशाजनक तरीकों को लिया और उन्हें चार अलग-अलग प्रकार के मानव ऊतकों: यकृत (लीवर), गुर्दा (किडनी), मूत्राशय (ब्लैडर) और अग्न्याशय (पैनक्रियाज) पर परखा। परिणाम सभी पर समान रहे। मशीन ने नमक के घोल का उपयोग करके लगातार सबसे लंबे, अखंड डीएनए धागे उत्पन्न किए, चाहे ऊतक का प्रकार कुछ भी हो। मशीन ने लाइसिस बफर का उपयोग करके लगातार डीएनए की उच्चतम मात्रा प्रदान की, लेकिन धागे छोटे थे।
अध्ययन यह निष्कर्ष निकालता है कि जमे हुए ऊतकों को तोड़ने का कोई एक "सर्वश्रेष्ठ" तरीका नहीं है; सही चुनाव पूरी तरह से इस बात पर निर्भर करता है कि वैज्ञानिक को आगे क्या चाहिए। यदि लक्ष्य जेनेटिक सामग्री की अधिकतम मात्रा प्राप्त करना है, शायद एक त्वरित विश्लेषण के लिए जहाँ धागे की लंबाई इतनी महत्वपूर्ण नहीं है, तो विशेष लाइसिस बफर के साथ मशीन एक बेहतर उपकरण है। लेकिन यदि लक्ष्य उन्नत अनुक्रमण (सीक्वेंसिंग) करना है जिसके लिए बहुत लंबे, अखंड डीएनए धागों की आवश्यकता होती है, तो नमक के घोल का उपयोग करने वाली मशीन स्पष्ट विजेता है। यह कार्य बायोबैंकों का प्रबंधन करने वाले वैज्ञानिकों को एक व्यावहारिक मार्गदर्शिका प्रदान करता है, यह सुनिश्चित करता है कि उनके पास मौजूद बहुमूल्य जमे हुए नमूनों को इस तरह से संसाधित किया जाए कि उनके भीतर के जेनेटिक कोड की अखंडता बनी रहे, जिससे भविष्य की खोजें उच्च-गुणवत्ता वाले डेटा की नींव पर निर्मित हो सकें।
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