BFF-piRNA-seq reveals conserved processing hotspots in flies and mice

जानवरों की प्रजनन कोशिकाओं के भीतर, फल मक्खियों से लेकर मनुष्यों तक, अगली पीढ़ी के आनुवंशिक ब्लूप्रिंट की रक्षा करने के लिए एक शांत और महत्वपूर्ण रक्षा प्रणाली कार्य करती है। यह प्रणाली आरएनए (RNA) के छोटे टुकड़ों पर निर्भर करती है, जिन्हें piRNA कहा जाता है, जो PIWI नामक प्रोटीनों की एक टीम के लिए मार्गदर्शक के रूप में कार्य करते हैं। उनका काम खतरनाक गतिशील आनुवंशिक तत्वों का पता लगाना और उन्हें शांत करना है, जिन्हें अक्सर ट्रांसपोसोन (transposons) कहा जाता है, जो जीनोम में इधर-उधर कूद सकते हैं और उत्परिवर्तन या बांझपन का कारण बन सकते हैं। इस सुरक्षा के बिना, जर्मलाइन (germline) की अखंडता से समझौता हो जाएगा, जिससे बंध्यता आ सकती है। दशकों से, वैज्ञानिक जानते थे कि ये अणु मौजूद हैं और आवश्यक हैं, लेकिन उनकी एक स्पष्ट, सटीक गिनती करना कठिन था। इन सूक्ष्म मार्गदर्शकों का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली मानक विधियों में एक अव्यवस्थित, मैन्युअल प्रक्रिया शामिल थी जो अक्सर परिणामों को विकृत कर देती थी, जिससे यह देखना कठिन हो जाता था कि ये सुरक्षात्मक अणु कैसे बनाए जाते हैं और वितरित किए जाते हैं।

राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (National Institutes of Health) के शोधकर्ताओं के एक दल ने अब इन अणुओं का अध्ययन करने का एक नया तरीका विकसित किया है जो पुराने विकृतियों को हटा देता है और यह प्रकट करता है कि वे किस तरह से व्यवस्थित हैं। उन्होंने एक विधि बनाई जिसे BFF-piRNA-seq कहा जाता है, जो एक ऐसी प्रक्रिया है जो बोना फाइडे (bona fide), जेल-मुक्त (gel-free) और लेबल-मुक्त (label-free) है। अणुओं को आकार के आधार पर अलग करने के लिए नमूनों को जेल के माध्यम से चलाने की पारंपरिक, श्रम-साध्य तकनीक के बजाय, यह नया दृष्टिकोण अनुक्रमण (sequencing) के लिए आवश्यक टैग को आरएनए से सीधे उसके PIWI प्रोटीन साथी से जुड़े रहने के दौरान ही जोड़ देता है। इस टैगिंग प्रक्रिया के दौरान आरएनए को प्रोटीन से जुड़े रहने देकर, शोधकर्ता उस विशिष्ट सामग्री को धोकर निकाल सकते हैं जिसे वे अध्ययन करना चाहते हैं, बिना उन विशिष्ट अणुओं को खोए जिनका वे अध्ययन करना चाहते हैं। यह जेल चरण की आवश्यकता को समाप्त करता है, जो अक्सर आरएनए के कुछ आकारों को गलती से त्यागकर या किसी शोधकर्ता द्वारा जेल काटने के आधार पर दूसरों को प्राथमिकता देकर पूर्वाग्रह पैदा करता था।

इस सुव्यवस्थित पद्धति का उपयोग करते हुए, टीम ने फल मक्खियों और चूहों दोनों में piRNAs का परीक्षण किया, जो दो बहुत अलग जानवर हैं जो इस प्राचीन जैविक रक्षा प्रणाली को साझा करते हैं। उन्होंने अपनी सटीकता सुनिश्चित करने के लिए अपने नए डेटा की तुलना पुराने, जेल-आधारित तरीकों से की। परिणामों ने दिखाया कि नई विधि अत्यधिक सुसंगत डेटा प्रदान करती है जो इन अणुओं के ज्ञात जीव विज्ञान, जैसे कि उनकी विशिष्ट लंबाई और इस तथ्य से मेल खाती है कि वे अक्सर उनके आनुवंशिक कोड में एक विशेष अक्षर से शुरू होते हैं। हालांकि, नई विधि ने पिछले तकनीकों की तुलना में piRNA आबादी की बहुत व्यापक और अधिक पूर्ण तस्वीर पेश की, विशेष रूप से फल मक्खियों में, जहाँ इसने पहले की तुलना में बहुत अधिक विशिष्ट अणु खोजे।

इस कार्य की सबसे महत्वपूर्ण खोज इन सुरक्षात्मक अणुओं को उत्पन्न करने के तरीके में एक संरक्षित पैटर्न है। शोधकर्ताओं ने पाया कि piRNAs उनके लंबे जनक स्ट्रैंड्स (parent strands) के साथ समान रूप से उत्पादित नहीं होते हैं। इसके बजाय, उत्पादन 'हॉटस्पॉट्स' (hotspots) नामक संकीर्ण, अत्यधिक सक्रिय क्षेत्रों में केंद्रित होता है। इन छोटी खिड़कियों के भीतर, piRNAs बनाने वाली मशीनरी जनक आरएनए के उन्हीं छोटे खंडों को बार-बार सैंपल करती है, लेकिन यह हर बार बिल्कुल उसी स्थान पर नहीं काटती है। इसके परिणामस्वरूप निकट से संबंधित piRNAs के परिवार बनते हैं जो लगभग समान होते हैं, लेकिन उनके शुरुआती सिरों पर मामूली भिन्नताएं होती हैं। ये भिन्नताएं, जिन्हें शोधकर्ता माइक्रोहेटरोजेनिटी (microheterogeneity) कहते हैं, केवल कुछ न्यूक्लियोटाइड्स की बहुत कम सीमा के भीतर होती हैं।

उत्पादन का यह केंद्रित पैटर्न फल मक्खियों और चूहों दोनों में समान पाया गया, जो यह सुझाव देता है कि यह एक मौलिक नियम है कि जीव अपनी आनुवंशिक सामग्री की रक्षा कैसे करते हैं। हॉटस्पॉट्स बड़ी संख्या में संबंधित मार्गदर्शकों को उत्पन्न करते हैं, जबकि हॉटस्पॉट्स के बीच के विशाल आरएनए क्षेत्र सक्रिय अणुओं के अंतिम पूल में बहुत कम योगदान देते हैं। डेटा ने एक लंबे समय से चले आ रहे प्रश्न को भी स्पष्ट किया कि ये अणु एक विशिष्ट अनुक्रम में कैसे बनते हैं। पहले के अध्ययनों ने सुझाव दिया था कि एक piRNA के निर्माण से अगले एक की रचना एक श्रृंखला की तरह शुरू हो सकती है, जैसे धागे में पिरोए गए मोती। हालांकि, इस नई विधि से प्राप्त उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा ने ऐसी किसी भी श्रृंखला अभिक्रिया (chain reaction) का कोई प्रमाण नहीं दिखाया। इसके बजाय, अणुओं के शुरुआती बिंदुओं में भिन्नता को बेहतर ढंग से समझाया जा सकता है कि प्रसंस्करण मशीनरी जनक आरएनए के उसी संकीर्ण क्षेत्र को बार-बार सैंपल कर रही है, न कि एक सख्त, चरण-दर-चरण असेंबली लाइन का पालन कर रही है।

शोधकर्ताओं ने कई व्यक्तिगत चूहों और मक्खियों के नमूनों का विश्लेषण करके यह पुष्टि की कि ये हॉटस्पॉट्स वास्तविक और पुनरुत्पादक (reproducible) हैं, यह पाते हुए कि वही संकीर्ण शिखर (peaks) हर विषय में लगातार दिखाई दिए। उन्होंने विशिष्ट आनुवंशिक अनुक्रमों की भी जांच की जो एक संकेत के रूप में कार्य कर सकते हैं कि मशीनरी को कहाँ काटना है, लेकिन इसमें कोई सार्वभौमिक कोड नहीं मिला। यह सुझाव देता है कि इन हॉटस्पॉट्स का स्थान एक सरल आनुवंशिक अनुक्रम के बजाय अन्य कारकों द्वारा निर्धारित होता है, शायद आरएनए के आकार या अन्य प्रोटीनों द्वारा जो अभी तक पूरी तरह से समझे नहीं गए हैं।

इन अणुओं का एक स्पष्ट और अधिक सटीक दृश्य प्रदान करके, यह नई विधि वैज्ञानिकों के लिए piRNA प्रणाली के आउटपुट को मापने के तरीके को बदल देती है। यह दिखाती है कि प्रणाली अत्यधिक चयनात्मक है, जो अपने प्रयासों को जनक आरएनए की पूरी लंबाई में फैलाने के बजाय, गाइडों की एक विशाल संख्या उत्पन्न करने के लिए कुछ उत्पादक स्थलों पर केंद्रित करती है। यह केंद्रित दृष्टिकोण जीव को नए खतरों के रूप में उभरने वाले नए खतरों के खिलाफ एक मजबूत रक्षा बनाए रखने के लिए पर्याप्त लचीला रखते हुए, आनुवंशिक आक्रमणकारियों के विरुद्ध एक मजबूत बचाव बनाए रखने की अनुमति दे सकता है। यह अध्ययन स्थापित करता है कि यह हॉटस्पॉट-संचालित संगठन piRNA जीव विज्ञान की एक साझा विशेषता है, जो यह समझने के लिए एक नया आधार प्रदान करता है कि जानवरों के साम्राज्य में प्रजनन क्षमता और जीनोम स्थिरता को कैसे बनाए रखा जाता है।