An accessible peptide-conjugated morpholino assay reveals sequence-specific reduction of reporter fluorescence in Escherichia coli
यह अध्ययन *Escherichia coli* में pGLO प्रणाली का उपयोग करते हुए एक सरल, टाइम-कोर्स फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी परख प्रस्तुत करता है, जो यह प्रदर्शित करता है कि GFP ट्रांसलेशन-इनिशिएशन क्षेत्र को लक्षित करने वाले पेप्टाइड-कंजुगेटेड मॉर्फोलिनोज (PPMOs), स्कैम्बलड कंट्रोल्स और अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में अनुक्रम-विशिष्ट तरीके से प्रति-सेल फ्लोरोसेंस को महत्वपूर्ण रूप से कम करते हैं।
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बैक्टीरिया की सूक्ष्म दुनिया में, जीन निर्देश पुस्तिकाओं (instruction manuals) के रूप में कार्य करते हैं, जो कोशिका को बताते हैं कि कौन से प्रोटीन बनाने हैं और कब। वैज्ञानिक लंबे समय से इन पुस्तिकाओं को पढ़ने और, अधिक महत्वपूर्ण रूप से, विशिष्ट पृष्ठों को अस्थायी रूप से छिपाने के तरीके खोज रहे हैं ताकि कोशिका कुछ निर्देशों का पालन करना बंद कर दे। इसके लिए एक शक्तिशाली उपकरण एक कृत्रिम अणु है जिसे मॉर्फोलिनो (morpholino) कहा जाता है। प्राकृतिक डीएनए या आरएनए के विपरीत, जो नाजुक होते हैं और कोशिका के अपने एंजाइमों द्वारा आसानी से नष्ट हो जाते हैं, मॉर्फोलिनों एक मजबूत, मानव-निर्मित बैकबोन से बने होते हैं जो विनाश का विरोध करते हैं। वे कोशिका के माध्यम से तैरते हैं और मैसेंजर आरएनए (messenger RNA) के एक विशिष्ट स्ट्रैंड से जुड़ जाते हैं, जो प्रोटीन बनाने वाली मशीनरी के लिए निर्देशों को ले जाने वाली जीन की एक प्रति है। इस मार्ग को भौतिक रूप से अवरुद्ध करके, मॉर्फोलिनो एक बाधा (roadblock) की तरह कार्य करता है, जिससे कोशिका को जीन पढ़ने और प्रोटीन बनाने से रोका जा सके। इस प्रक्रिया को स्टेरिक ब्लॉकिंग (steric blocking) कहा जाता है।
हालाँकि, इन अणुओं को बैक्टीरिया के अंदर पहुँचाना कठिन है। बैक्टीरिया के पास कठोर बाहरी कवच होते हैं जो स्वाभाविक रूप से ऐसे बड़े, विदेशी अणुओं को प्रतिकर्षित करते हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, शोधकर्ता मॉर्फोलिनो के साथ एक विशेष पेप्टाइड जोड़ते हैं, जो अमीनो एसिड की एक छोटी श्रृंखला है और एक चाबी के रूप la तरह कार्य करती है। यह चाबी अणु को बैक्टीरियल दीवार के माध्यम से फिसलने में मदद करती है। हालाँकि यह वितरण विधि अच्छी तरह से समझी गई है, लेकिन एक जीवित बैक्टीरिया के भीतर यह सटीक रूप से मापना कि वह किसी विशिष्ट जीन को काम करने से रोकने में कितना प्रभावी है, एक चुनौती रही है। पारंपरिक तरीकों के लिए अक्सर महंगे, उच्च-तकनीकी उपकरणों की आवश्यकता होती है या माप लेने के लिए कोशिकाओं को नष्ट करना पड़ता है, जिससे प्रक्रिया को समय के साथ चलते हुए देखना कठिन हो जाता है।
विंडवर्ड स्कूल के दो शोधकर्ताओं ने इस आणविक बाधा को क्रिया में देखने का एक सरल, अधिक सुलभ तरीका विकसित किया है। उन्होंने 'एस्चेरिचिया कोली' (Escherichia coli) बैक्टीरिया के एक सामान्य स्ट्रेन का उपयोग किया जिसे इस तरह इंजीनियर किया गया था कि जब एक विशिष्ट जीन सक्रिय होता है, तो वह हरा चमकने लगता है। यह जीन, जो एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन करता है, अरबिनोज (arabinose) नामक एक चीनी को कल्चर में मिलाने पर चालू हो जाता है। शोधकर्ताओं ने एक मॉर्फोलिनो पेश किया जिसे इस हरे प्रोटीन के निर्देशों की शुरुआत को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जिसका अर्थ था चमक शुरू होने से पहले ही उसे रोकने का प्रयास करना। उन्होंने इस लक्षित अणु की तुलना दो अन्य स्थितियों से की: एक नियंत्रण अणु (control molecule) जिसमें एक स्कैम्बल (scrambled), गैर-कार्यात्मक अनुक्रम था, और एक समूह जिसमें बैक्टीरिया को कोई अणु नहीं दिया गया था।
टीम ने इन बैक्टीरिया को एक मानक प्रयोगशाला डिश में रखा और एक पारंपरिक फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पांच घंटे की अवधि तक उन्हें देखा। जटिल स्वचालित प्रणालियों पर निर्भर रहने के बजाय, उन्होंने छवियों में बैक्टीरिया की गणना मैन्युअल रूप से की और प्रत्येक कोशिका से आने वाली हरी रोशनी की चमक को मापा। उन्होंने पाया कि लक्षित मॉर्फोलिनो से उपचारित बैक्टीरिया में अन्य की तुलना में हरी रोशनी में महत्वपूर्ण गिरावट आई। विशेष रूप से, जीन चालू होने के चार से पांच घंटे बाद, लक्षित मॉर्फोलिनो ने स्कैम्बल कंट्रोल की तुलना में प्रति कोशिका हरे रंग की चमक को लगभग 61 से 66 प्रतिशत तक और बिना उपचारित बैक्टीरिया की तुलना में लगभग 55 से 62 प्रतिशत तक कम कर दिया।
यह कमी डेटा मापने के तरीके का कोई संयोग नहीं थी। शोधकर्ताओं ने अपने परिणामों का परीक्षण चमक की गणना करने के तीन अलग-अलग तरीकों से किया, और चमक में गिरावट सभी में सुसंगत रही। तथ्य यह है कि स्कैम्बल कंट्रोल, जिसमें बिल्कुल समान रासायनिक संरचना और वितरण चाबी थी लेकिन एक अलग आंतरिक अनुक्रम था, ने चमक को कम नहीं किया, यह सुझाव देता है कि प्रभाव मॉर्फोलिनो के सामान्य दुष्प्रभाव के बजाय मॉर्फोलिनो के विशिष्ट अनुक्रम के जीन से मेल खाने के कारण था। सभी समूहों में बैक्टीरिया बढ़ते रहे, जो दर्शाता कि रोशनी में गिरावट कोशिकाओं के मरने या उनके विकास के रुकने के कारण नहीं, बल्कि जीन के ब्लॉक होने के कारण थी।
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि एक मानक माइक्रोस्कोप, सावधानीपूर्वक गणना पद्धति के साथ मिलकर, यह साबित करने के लिए पर्याप्त है कि ये पेप्टाइड-संयुग्मित (peptide-conjugated) अणु सफलतापूर्वक बैक्टीरिया में प्रवेश कर सकते हैं और विशिष्ट जीनों को शांत कर सकते हैं। शोधकर्ताओं ने देखा कि प्रभाव दिखने में समय लगता है, उपचारित और अनुपचारित समूहों के बीच का अंतर केवल तभी स्पष्ट हुआ जब अनुपचारित कोशिकाओं में प्रोटीन जमा होने के लिए पर्याप्त समय मिल गया। यह समय-निर्भर प्रकृति पुष्टि करती है कि मॉर्फोलिनो मौजूदा प्रोटीन को नष्ट करने के बजाय नए प्रोटीन के निर्माण को रोक रहा है। यह दिखाकर कि यह अनुक्रम-विशिष्ट ब्लॉकिंग एक जीवित बैक्टीरियल सिस्टम में बिना किसी विशेष, उच्च-लागत वाले उपकरणों की आवश्यकता के काम करती है, यह कार्य अन्य वैज्ञानिकों के लिए इन जीन-साइलेंसिंग उपकरणों का परीक्षण और सुधार करने के लिए एक व्यावहारिक और पारदर्शी तरीका प्रदान करता है। निष्कर्ष एक 'प्रूफ ऑफ कॉन्सेप्ट' बने हुए हैं, जो दो अलग-अलग प्रयोगों के सेट में एक स्पष्ट दिशात्मक प्रभाव दिखाते हैं, और भविष्य के अध्ययन के लिए आधार तैयार करते हैं जो इस सुलभ दृष्टिकोण का उपयोग करके विभिन्न सांद्रता या अन्य जीनों को लक्षित कर सकते हैं।
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