Size dependent loss of structural variant allele counts in pangenome derived VCFs

प्रत्येक मनुष्य में डीएनए की भाषा में लिखी गई निर्देशों का एक अनूठा सेट होता है। हालांकि इस कोड का बहुत सा हिस्सा एक व्यक्ति से दूसरे व्यक्ति में समान होता है, लेकिन जो अंतर होते हैं वही हमें व्यक्तिगत बनाते हैं और हमारे स्वास्थ्य को प्रभावित करते हैं। वैज्ञानिकों ने लंबे समय से कोड में होने वाले सूक्ष्म, एकल-अक्षर परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित किया है, जिन्हें पहचानना और दर्ज करना आसान है। हालांकि, सबसे नाटकीय अंतर अक्सर डीएनए के बड़े खंडों में होते हैं—कभी-कभी हजारों अक्षरों लंबे—जो हटा दिए जाते हैं, डुप्लिकेट हो जाते हैं या उलट-पुलट जाते हैं। इन्हें स्ट्रक्चरल वेरिएंट्स (structural variants) कहा जाता है। क्योंकि ये इतने बड़े और जटिल होते हैं, इसलिए इन्हें एकल-अक्षर परिवर्तनों की तुलना में मैप करना बहुत कठिन होता है। अतीत में, वैज्ञानिकों ने इन बड़े, जटिल अंतरों को एक सरल, रैखिक सूची में फिट करने की कोशिश की, ठीक वैसे ही जैसे किसी घुमावदार पहाड़ी रास्ते का वर्णन केवल उन सीधे राजमार्ग खंडों को सूचीबद्ध करके करने की कोशिश की जाए जिनसे वह गुजरता है। इस दृष्टिकोण में अक्सर यह महत्वपूर्ण विवरण खो जाता था कि वास्तव में कितने लोग एक विशिष्ट परिवर्तन के वाहक थे।

इसे हल करने के लिए, शोधकर्ताओं ने हाल ही में जेनेटिक डेटा को संग्रहीत करने का एक नया तरीका विकसित किया जिसे 'पैनजीनोम ग्राफ' (pangenome graph) कहा जाता है। एक एकल सीधी रेखा के बजाय, यह ग्राफ कई अलग-अलग लोगों के डीएनए अनुक्रमों को एक एकल, शाखाओं वाली संरचना में बुनता है। इस मानचित्र में, प्रत्येक व्यक्ति का डीएनए एक पथ है जो एक ही परिदृश्य के माध्यम से घूमता है, जो विभिन्न बिंदुओं पर अलग होता है और फिर से जुड़ जाता है। यह वैज्ञानिकों को बड़े स्ट्रक्चरल वेरिएंट्स को जबरन लगाए गए एनोटेशन के बजाय परिदृश्य की प्राकृतिक विशेषताओं के रूप में देखने की अनुमति देता है। हालांकि, बीमारी और विकास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लगभग सभी सॉफ्टवेयर अभी भी पुराने, सरल सूची प्रारूप की अपेक्षा करते हैं। नए ग्राफ का उपयोग करने के लिए, वैज्ञानिकों को इसे वापस एक सूची में बदलना होगा, जो एक प्रक्रिया है जो दो बहुत अलग भाषाओं के बीच अनुवादक के रूप में कार्य करती है। महत्वपूर्ण प्रश्न यह था कि क्या यह अनुवाद प्रक्रिया इस बात के वास्तविक आंकड़े को सुरक्षित रखती है कि कितने लोग एक विशिष्ट बड़े वेरिएंट के वाहक हैं, या क्या डेटा को बदलने की प्रक्रिया जानकारी को खंडित कर देती है।

शोधकर्ताओं की एक टीम ने ठीक इसी बात का परीक्षण करने के लिए एक प्रयोग किया। उन्होंने एक नियंत्रित प्रयोग बनाया जहाँ वे शुरू करने से पहले ही उत्तर जानते थे। वास्तविक मानव डीएनए अनुक्रमों को आधार बनाकर, उन्होंने बीस व्यक्तियों के पैनल का अनुकरण किया, जिसमें विशिष्ट स्थानों पर बड़े स्ट्रक्चरल वेरिएंट्स को सावधानीपूर्वक रखा गया और उन्हें ज्ञात वाहकों को सौंपा गया। चूंकि उन्होंने स्वयं यह प्रयोग डिजाइन किया था, इसलिए वे जानते थे कि प्रत्येक वेरिएंट को ले जाने वाले व्यक्तियों की सटीक संख्या क्या थी। इसके बाद उन्होंने इस सिम्युलेटेड डेटा से एक पैनजीनोम ग्राफ बनाया और इसे प्रमुख अनुसंधान कंसोर्टियम द्वारा उपयोग किए जाने वाले मानक रूपांतरण पाइपलाइन के माध्यम से चलाकर वापस एक सूची में बदल दिया। अपनी मूल सच्चाई के विरुद्ध अंतिम सूची की तुलना करके, वे देख सके कि यात्रा के दौरान कौन सी जानकारी बची रही और क्या खो गया।

परिणामों ने एक स्पष्ट और व्यवस्थित समस्या को उजागर किया। छोटे वेरिएंट्स के लिए, रूपांतरण लगभग पूरी तरह से काम करता था, जिससे वाहकों की संख्या सुरक्षित रहती थी। लेकिन जैसे-जैसे वेरिएंट का आकार बढ़ता गया, वाहकों की गणना की सटीकता तेजी से गिरती गई। 100 अक्षरों लंबे वेरिएंट्स के लिए, रूपांतरण ने लगभग हर मामले में वाहक संख्या की सही पहचान की। हालांकि, 30,000 अक्षरों लंबे वेरिएंट्स के लिए, सही संख्या केवल आधे मामलों में ही प्राप्त की जा सकी। वेरिएंट जितना बड़ा होता, रूपांतरण प्रक्रिया के डेटा को खंडित करने, यानी वाहकों के एक एकल समूह को कई छोटे, असंबंधित समूहों में विभाजित करने की संभावना उतनी ही अधिक होती थी। यह विखंडन जीनोम के उन क्षेत्रों में और भी बदतर था जो पहले से ही पढ़ने में कठिन हैं, जिन्हें 'सेगमेंटल डुप्लीकेशन' (segmental duplications) के रूप में जाना जाता है, जहाँ सबसे बड़े वेरिएंट्स के लिए सही गणना 40 प्रतिशत से भी कम प्राप्त हुई।

शोधकर्ताओं ने इस त्रुटि के स्रोत का पता रूपांतरण प्रक्रिया के बिल्कुल पहले चरण में लगाया। जब ग्राफ को एक सूची में तोड़ा जाता है, तो सॉफ्टवेयर "बबल्स" (bubbles) की तलाश करता है—वे खंड जहाँ पथ अलग होते हैं और फिर से जुड़ जाते हैं। यह प्रत्येक अद्वितीय पथ को एक अलग वेरिएंट के रूप में मानता है। क्योंकि बड़े बबल्स में अक्सर वाहकों के बीच कई छोटे, असंबंधित अंतर होते हैं, इसलिए सॉफ्टवेयर गलती से एक बड़े विलोपन (deletion) को दर्जनों थोड़े अलग घटनाओं के रूप में देखता है। पाइपलाइन के बाद के चरण, जो सूची को साफ करने और सरल बनाने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, इस मौलिक गलतफहमी को ठीक नहीं कर सके। वे कुछ अंशों को मर्ज कर सकते थे, लेकिन वे मूल, एकीकृत वाहक समूह को पुनर्गठित नहीं कर सके क्योंकि प्रारंभिक विभाजन ने पहले ही संबंध को खो दिया था।

यह साबित करने के लिए कि यह रूपांतरण पद्धति में एक दोष था न कि ग्राफ में एक दोष, टीम ने एक अलग दृष्टिकोण अपनाया। ग्राफ को पहले सूची में बदलने के बजाय, उन्होंने ग्राफ पथों के माध्यम से सीधे वाहकों को गिनने वाला एक टूल लिखा। इस पद्धति ने अनुवाद को पूरी तरह से दरकिनार कर दिया। जब उन्होंने इस प्रत्यक्ष गणना पद्धति का उपयोग किया, तो उन्होंने वेरिएंट के आकार की परवाह किए बिना, 99 प्रतिशत वेरिएंट्स के लिए सही वाहक संख्या प्राप्त की। इसने प्रदर्शित किया कि जानकारी ग्राफ में अभी भी मौजूद थी, लेकिन ग्राफ को सूची में बदलने की मानक विधि इसे सही ढंग से पढ़ने में विफल रही। समस्या मानचित्र के साथ नहीं थी, बल्कि मानचित्र को पढ़े जाने के तरीके के साथ थी।

टीम ने वास्तविक दुनिया के डेटा को देखने के लिए 'ह्यूमन पैनजीनोम रेफरेंस कंसोर्टियम' का उपयोग किया कि क्या यह समस्या उनके सिमुलेशन के बाहर भी मौजूद है। उन्होंने मानव आबादी में पाए जाने वाले एक विशिष्ट बड़े विलोपन (deletion) का परीक्षण किया, जिसे 461 में से 216 व्यक्तियों द्वारा वहन किया जाता है। कच्चे ग्राफ डेटा में, यह एकल घटना 84 अलग-अलग एलील्स (alleles) के रूप में दिखाई देती थी, जिसमें सबसे बड़ा समूह केवल 25 वाहकों वाला था। जब उन्होंने अंतिम प्रकाशित सूची को देखा, तो वह घटना चार अलग-अलग रिकॉर्ड्स में विभाजित हो गई थी। हालांकि सभी को जोड़ने पर कुल वाहकों की संख्या लगभग सही थी, लेकिन घटना को अब एक एकल इकाई के रूप में नहीं पहचाना जा सका। कोई भी विश्लेषण जो जीनोम में मौजूद विशिष्ट स्ट्रक्चरल वेरिएंट्स की संख्या को गिनता है, वह गलती से इस एक घटना को चार के रूप में गिनेगा, जिससे विविधता का अतिरंजित चित्रण होगा और यह समझने में बाधा आएगी कि वह वेरिएंट वास्तव में कितना सामान्य था।

अध्ययन निष्कर्ष निकालता है कि जबकि पैनजीनोम ग्राफ मानव आनुवंशिक विविधता की एक अधिक पूर्ण तस्वीर प्रदान करते हैं, डेटा साझा करने और विश्लेषण करने वाले मानक उपकरण वर्तमान में सबसे महत्वपूर्ण जानकारी को नष्ट कर रहे हैं। वाहकों की संख्या का नुकसान कोई दुर्लभ त्रुटि नहीं है, बल्कि डेटा को अनुवादित करने के तरीके का एक अनुमानित परिणाम है। शोधकर्ता सुझाव देते हैं कि बड़े स्ट्रक्चरल वेरिएंट्स की आवृत्ति पर आधारित अध्ययनों के लिए, वैज्ञानिकों को रूपांतरित सूचियों पर भरोसा करने के बजाय ग्राफ पथों से सीधे वाहकों की गणना करनी चाहिए। यह दृष्टिकोण तेज़ और कहीं अधिक सटीक है, जो यह सुनिश्चित करता है कि एक जटिल मानचित्र से एक सरल सूची में अनुवाद के दौरान वास्तविक आनुवंशिक विविधता खो न जाए।