Characterization and considerations of mouse Cre lines targeting cerebellar granule cells in early postnatal development

मस्तिष्क अरबों कोशिकाओं का एक विशाल, जटिल शहर है, जिनमें से प्रत्येक का एक विशिष्ट कार्य होता है। यह समझने के लिए कि यह शहर कैसे कार्य करता है, या ऑटिज्म जैसी स्थितियों में यह कभी-कभी क्यों खराब हो जाता है, वैज्ञानिकों को पूरे मानचित्र को अंधेरा किए बिना केवल एक पड़ोस की बत्तियाँ बंद करने में सक्षम होना चाहिए। दशकों से, शोधकर्ता बिल्कुल यही करने के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण का उपयोग करते रहे हैं। वे चूहों को इस तरह से इंजीनियर करते हैं कि न्यूरॉन्स के एक विशिष्ट प्रकार को आनुवंशिक संशोधन के लिए लक्षित किया जा सके, जिससे उन्हें यह अध्ययन करने की अनुमति मिलती है कि जब उस सटीक समूह के न्यूरॉन्स से एक एकल जीन को हटा दिया जाता है, तो क्या होता है। यह विधि एक आणविक स्विच पर निर्भर करती है जिसे चालू या बंद किया जा सकता है, लेकिन स्विच के सही ढंग से काम करने के लिए, वैज्ञानिकों को यह सुनिश्चित करना होगा कि वह सही जगह पर सही स्विच को ही घुमा रहा है। यदि स्विच ढीला है या गलत पड़ोस में घूम जाता है, तो प्रयोग के परिणाम भ्रमित करने वाले हो जाते हैं, और मानव रोग के बारे में सीखे गए सबक भ्रामक हो सकते हैं।

सेरिबेलम (cerebellum) में, जो मस्तिष्क का एक हिस्सा है और गति तथा संतुलन को समन्वित करने के लिए महत्वपूर्ण है, ग्रैन्यूल कोशिकाओं (granule cells) नामक सूक्ष्म न्यूरॉन्स की एक घनी परत होती है। ये कोशिकाएं एक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जानी जाती हैं जिसे शँक3 (Shank3) कहा जाता है, जो मस्तिष्क की कोशिकाओं के आपस में संवाद करने के तरीके के लिए महत्वपूर्ण है। जब शँक3 अनुपस्थित होता है, तो यह गंभीर विकासात्मक विकारों का कारण बन सकता है। इसका अध्ययन करने के लिए, सदर्न इलिनोइस यूनिवर्सिटी के शोधकर्ताओं ने यह पता लगाने के लिए प्रयास किया कि चूहे के जीवन के शुरुआती दिनों के दौरान विशेष रूप से इन ग्रैन्यूल कोशिकाओं में शँक3 जीन को बंद करने का सबसे अच्छा तरीका क्या है। उन्होंने तीन अलग-अलग आनुवंशिक "ड्राइवर" लाइनों का परीक्षण किया, जो अनिवार्य रूप से निर्देशों के अलग-अलग सेट हैं जिन्हें यह बताने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि आनुवंशिक स्विच कहाँ जाना चाहिए। लक्ष्य यह पहचानना था कि कौन सा ड्राइवर एक सटीक लेजर की तरह कार्य करेगा, जो पूरे कमरे में स्प्रे बोतल की तरह छिड़कने के बजाय केवल ग्रैन्यूल कोशिकाओं पर प्रहार करे।

टीम ने इन तीन अलग-अलग ड्राइवर लाइनों को एक विशेष रिपोर्टर चूहे के साथ क्रॉस किया। यह रिपोर्टर चूहा एक ऐसा जीन वहन करता है जो लाल रंग में चमकता है जब आनुवंशिक स्विच सफलतापूर्वक चालू हो जाता है। माइक्रोस्कोप के नीचे इन चूहों के मस्तिष्क को देखकर, शोधकर्ता देख सकते थे कि लाल रोशनी वास्तव में कहाँ दिखाई दी। एक ड्राइवर, जिसे Atoh1-CreERTM कहा जाता है, ने शानदार प्रदर्शन किया। टैमोक्सिफ़ेन (tamoxifen) नामक दवा द्वारा सक्रिय होने पर, इसने पूरे सेरिबेलम में लगभग हर ग्रैन्यूल कोशिका में लाल चमक पैदा की, और महत्वपूर्ण रूप से, यह बाकी मस्तिष्क से दूर रही। एक अन्य ड्राइवर, Atoh1-Cre ने भी सेरिबेलम को रोशन किया, लेकिन यह कम सुसंगत था, कुछ क्षेत्रों को छोड़ देता था और अधिक समस्यात्मक रूप से, यह मस्तिष्क के अन्य हिस्सों में भी लाल चमक पैदा कर रहा था जहाँ इसे नहीं होना चाहिए था। तीसरा ड्राइवर, Nse-CreERT2, सबसे कम प्रभावी था, जो केवल कुछ बिखरी हुई कोशिकाओं को रोशन करता था और गलत स्थानों पर भी दिखाई देता था। इन चमकते हुए मानचित्रों के आधार पर, शोधकर्ताओं ने अपने अगले चरण के लिए सबसे आशाजनक उपकरण के रूप में Atoh1-CreERTM लाइन को चुना।

अपने चुनाव पर आश्वस्त होकर, टीम ने इस सटीक ड्राइवर का उपयोग उन चूहों को बनाने के लिए किया जहाँ ग्रैन्यूल कोशिकाओं से शँक3 जीन को हटाया जाना था। उन्होंने जन्म के समय चूहों को सक्रिय करने वाली दवा का इंजेक्शन दिया और यह देखने के लिए प्रतीक्षा की कि क्या जीन गायब हो गया है। इसकी जाँच करने के लिए, उन्होंने केवल लाल चमक को नहीं देखा; उन्होंने मस्तिष्क के ऊतकों में शँक3 के वास्तविक मात्रा, यानी mRNA को मापा। यह एक महत्वपूर्ण अंतर है। रिपोर्टर चूहे से मिलने वाली लाल चमक एक बहुत ही संवेदनशील संकेत है; यह तब भी चालू हो सकती है जब आनुवंशिक स्विच केवल थोड़ा सा ही सक्रिय हो। हालाँकि, शँक3 जैसे बड़े जीन के वास्तविक विलोपन (deletion) के लिए उसी स्विच से बहुत अधिक शक्तिशाली और निरंतर दबाव की आवश्यकता होती है।

परिणाम आश्चर्यजनक थे। जबकि लाल चमक ने संकेत दिया कि लगभग सभी ग्रैन्यूल कोशिकाओं में आनुवंशिक स्विच चालू हो गया था, मस्तिष्क के ऊतकों में शँक3 mRNA की वास्तविक मात्रा केवल थोड़ी सी, लगभग बाईस प्रतिशत कम हुई थी। शोधकर्ताओं को उम्मीद थी कि जीन लगभग पूरी तरह से गायब हो जाएगा, जैसा कि अन्य प्रकार के चूहों में होता है जहाँ जन्म के समय ही जीन को हटा दिया जाता है। इसके बजाय, कोशिकाएं अभी भी उस प्रोटीन का अधिकांश हिस्सा बना रही थीं जिसे उन्हें खो देना चाहिए था। इस खोज ने एक छिपे हुए अंतर को प्रकट किया: चमकता हुआ मानचित्र जीन विलोपन की वास्तविकता से मेल नहीं खा रहा था। स्विच सही कोशिकाओं में चालू किया गया था, लेकिन इसे शँक3 जीन को हटाने के लिए आवश्यक बड़े आनुवंशिक खंड को पूरी तरह से मिटाने के लिए पर्याप्त ज़ोर से या पर्याप्त समय तक नहीं घुमाया गया था।

यह अध्ययन वैज्ञानिक समुदाय के लिए एक महत्वपूर्ण अनुस्मारक के रूप में कार्य करता है। यह दिखाता है कि किसी सेल को रिपोर्टर जीन के साथ चमकते हुए देखना यह साबित करने के लिए पर्याप्त प्रमाण नहीं है कि एक विशिष्ट जीन सफलतापूर्वक हटा दिया गया है। प्रक्रिया को दृश्यमान बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण अक्सर उस प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपकरणों की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं जो वास्तव में आनुवंशिक सर्जरी करने के लिए आवश्यक हैं। शोधकर्ताओं ने निष्कर्ष निकाला कि हालांकि Atoh1-CreERTM लाइन कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन यह शँक3 जीन जैसे बड़े डीएनए खंडों को इन विशिष्ट कोशिकाओं से हटाने के लिए अकेले पर्याप्त मजबूत नहीं हो सकती है। गति और व्यवहार में इस जीन की भूमिका को वास्तव में समझने के लिए, भविष्य के अध्ययनों को या तो अधिक शक्तिशाली आनुवंशिक ड्राइवर खोजना होगा या सक्रियण के समय और खुराक को समायोजित करना होगा ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि जीन पूरी तरह से हटा दिया गया है। जटिल मस्तिष्क विकारों को समझने के मार्ग के लिए न केवल सही उपकरणों की आवश्यकता है, बल्कि इस गहन सत्यापन की भी आवश्यकता है कि वे उपकरण ठीक वही कर रहे हैं जो उन्हें करना चाहिए।