Dynamic dark-field FFOCT and dynamic reflection differential phase contrast for label-free functional imaging at reflective biomaterial interfaces

Sintesi Tecnica: FFOCT a Campo Scuro Dinamico e Contrasto di Fase Differenziale a Riflessione Dinamica

Problematica
Le forti riflessioni speculari da substrati metallici e ingegnerizzati limitano severamente l'imaging funzionale senza etichetta di cellule viventi presso interfacce di biomateriali, come elettrodi neurali e dispositivi impiantabili. Nella convenzionale Tomografia a Coerenza a Campo Totale Dinamica (D-FFOCT), queste dominanti riflessioni del substrato sovrastano le deboli fluttuazioni temporali originate dalla dinamica intracellulare, determinando una marcata riduzione del contrasto intracellulare e limitando drasticamente la capacità di studiare le interazioni cellula-superficie. Sebbene la D-FFOCT auto-referenziata possa sopprimere gli artefatti di frangia presso interfacce debolmente riflettenti, essa rimane inefficace contro le forti riflessioni speculari.

Metodologia
Gli autori hanno investigato l'imaging funzionale presso interfacce riflettenti utilizzando una piattaforma di Full-Field Optical Coherence Tomography (FF-OCT) modificata basata su un interferometro di Linnik. Hanno introdotto e confrontato due strategie ottiche complementari per recuperare il contrasto dinamico intracellulare:

1. FFOCT a Campo Scuro Dinamico (D-dFFOCT): Questo approccio impiega un braccio di riferimento dedicato contenente un reticolo riflettente a blaze. Il reticolo introduce uno scostamento angolare tra il campo di riferimento e il campo di illuminazione. Un arresto nel piano di Fourier viene utilizzato per rigettare la dominante riflessione speculare del substrato, preservando al contempo l'interferenza tra il campo diffuso del campione e il campo di riferimento. Ciò rileva selettivamente la luce diffusa, sopprimendo il fondo.
2. Contrasto di Fase Differenziale a Riflessione Dinamica (D-RDPC): In questa configurazione, il braccio di riferimento dedicato viene rimosso e il substrato riflettente stesso funge da campo di riferimento in una geometria a percorso comune. L'illuminazione asimmetrica (ad esempio, pattern a mezzaluna o a punto di bordo) viene introdotta nel piano focale posteriore dell'obiettivo. Questo rompe la simmetria angolare dell'illuminazione, generando un contrasto dinamico direzionale.

Lo studio ha utilizzato cellule gliali di Müller derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate su substrati riflettenti rivestiti di argento. L'imaging è stato eseguito con una sorgente LED a banda larga (810 nm) e una telecamera CMOS. Le immagini dinamiche sono state generate analizzando le fluttuazioni temporali del segnale interferometrico utilizzando l'Indice di Fluttuazione di Fase (PhFI) e mappando la frequenza media e la deviazione standard rispettivamente su tonalità e saturazione.

Risultati Chiave

• Ripristino del Contrasto: Sia la D-dFFOCT che la D-RDPC hanno ripristinato sostanzialmente la visibilità intracellulare rispetto alla D-FFOCT convenzionale. La D-dFFOCT ha ottenuto questo risultato sopprimendo il fondo speculare, rivelando la morfologia cellulare e l'attività dinamica localizzata che erano precedentemente oscurate.
• Firme Direzionali della D-RDPC: La D-RDPC ha fornito il potenziamento più forte, rivelando l'attività intracellulare in tutto il campo visivo con firme direzionali e di contorno pronunciate, visibili anche negli interferogrammi grezzi.
• Verifica del Meccanismo di Gradiente di Fase: Gli autori hanno dimostrato che il segnale D-RDPC esibisce tre firme caratteristiche dell'imaging a contrasto di fase differenziale (DPC):
  1. Inversione del Contrasto: Invertendo la direzione dell'illuminazione di 180°, il segno del segnale misurato è stato invertito (le caratteristiche brillanti sono diventate scure).
  2. Scalabilità dell'Asimmetria: Aumentando il grado di asimmetria dell'illuminazione (ad esempio, passando da un'illuminazione a mezzaluna a una a punto di bordo), la magnitudo del contrasto dinamico è aumentata, ma simultaneamente è stata ampliata la risposta spaziale effettiva, indicando un compromesso tra sensibilità direzionale e localizzazione spaziale.
  3. Ricostruzione della Localizzazione: L'applicazione di una ricostruzione mediante trasformata di Hilbert direzionale (dHT) alle immagini statiche RDPC ha recuperato con successo la localizzazione spaziale, restringendo la larghezza apparente delle caratteristiche (ad esempio, da ~2,2 µm a ~0,83 µm) e sopprimendo gli estesi aloni direzionali. Ciò ha confermato che l'informazione spaziale era codificata nel segnale ma ridistribuita dalla funzione di trasferimento direzionale.

Contributi Chiave

• D-dFFOCT: Il lavoro presenta la prima applicazione del filtraggio a campo scuro alla D-FFOCT, stabilendo una soluzione pratica per l'imaging funzionale su substrati altamente riflettenti dove i metodi convenzionali falliscono.
• La D-RDPC come Modalità Funzionale: Il contributo primario è la dimostrazione che i segnali di Contrasto di Fase Differenziale a Riflessione (RDPC), tipicamente utilizzati per l'imaging strutturale, supportano l'analisi delle fluttuazioni temporali. Gli autori dimostrano che la D-RDPC codifica fluttuazioni temporali biologicamente significative, trasformando efficacementamente una modalità strutturale in una funzionale.
• Approfondimento Meccanicistico: Lo studio fornisce prove sperimentali che il contrasto osservato deriva da un meccanismo di imaging a gradiente di fase direzionale. Il segnale è interpretato come le fluttuazioni temporali di una quantità ottica direzionale ($D(r) \propto \langle|\Delta [u \cdot \nabla\phi(r, t)]|\rangle_t$), piuttosto che come un convenzionale segnale di scattering interferometrico.

Significatività e Rivendicazioni
L'articolo sostiene di aver stabilito nuove strategie per l'imaging funzionale presso interfacce riflettenti. Consentendo il recupero della dinamica intracellulare attraverso D-dFFOCT e D-RDPC, il lavoro affronta un limite critico nello studio delle interazioni cellula-materiale.

Fondamentalmente, gli autori suggeriscono che la microscopia DPC stessa possa essere estesa da una modalità strutturale verso una funzionale attraverso l'analisi delle fluttuazioni temporali. Essi postulano che la D-RDPC offra vantaggi pratici per l'imaging di oggetti di fase deboli poiché l'operazione di gradiente viene eseguita otticamente prima della rilevazione, fornendo potenzialmente caratteristiche di trasferimento del rumore più favorevoli rispetto alla differenziazione numerica. Sebbene l'attuale implementazione sia una prova di concetto che utilizza una semplice illuminazione a punto di bordo, gli autori suggeriscono che l'ottimizzazione futura dell'ingegneria del pupillo e degli algoritmi di ricostruzione potrebbe migliorare ulteriormente le prestazioni. Il lavoro unisce i campi della microscopia a gradiente di fase e dell'imaging a coerenza di gate, offrendo una via verso l'imaging funzionale con selezione di profondità e senza etichetta di sistemi viventi presso interfacce riflettenti.