Bidirectional phase sensitivity in holographic phototransient microscopy

Sintesi Tecnica: Sensibilità di Fase Bidirezionale nella Microscopia Olografica Fototransiente

Problematica
La microscopia fototermica nel medio infrarosso (MIP) offre un'elevata risoluzione spaziale e specificità chimica convertendo l'assorbimento vibrazionale in variazioni misurabili dell'indice di rifrazione lette a lunghezze d'onda del visibile. Tuttavia, l'implementazione pratica deve affrontare un persistente compromesso tra le geometrie di rilevamento a scattering frontale (FWS) e a scattering posteriore (BWS). La FWS fornisce un contrasto di fase quantitativo e indipendente dalla forma, ma richiede un accesso ottico su due lati, il che è difficile da ottenere in campioni acquosi o spessi. Al contrario, la BWS permette un accesso pratico su un solo lato, ma soffre di una forte interferenza dipendente dalla profondità per oggetti di scala micrometrica, portando a segnali distorti e a una perdita di informazioni strutturali. La letteratura attuale manca di una valutazione sistematica di come la geometria di rilevamento influenzi la sensibilità di fase fototermica in condizioni identiche, e gli esistenti setup bidirezionali si concentrano spesso sull'intensità dello scattering piuttosto che sulle misure di fase quantitativa.

Metodologia
Gli autori hanno sviluppato un microscopio olografico fototransiente nel medio infrarosso a femtosecondi, bidirezionale, capace di passare tra configurazioni FWS e BWS all'interno di un singolo strumento senza alterare il campione o l'eccitazione MIR. Il sistema utilizza un fascio sonda a 515 nm a femtosecondi e un pump MIR sintonizzabile (centrato a 1593 cm⁻¹). Le caratteristiche tecniche chiave includono:

• Commutazione Bidirezionale: Un supporto basculante (flip mount) consente la transizione rapida tra le configurazioni FWS e BWS/IFS (Internal Forward Scattering - Scattering Frontale Interno).
• Gating della Coerenza Temporale: Una linea di ritardo per l'onda di riferimento consente la selezione di termini di interferenza specifici in base alle differenze di cammino ottico. Ciò isola il segnale di interesse dalle riflessioni parassite.
• Elaborazione Olografica: Il sistema acquisisce ologrammi off-axis a 1 kHz, modulando il pump MIR a 500 Hz per generare fotogrammi alternati "caldi" (pump attivo) e "freddi" (pump spento). La fase differenziale è calcolata come la differenza di fase tra questi campi complessi.
• Validazione Sperimentale: Lo studio ha utilizzato microsfere di polistirene (PS) da 5 µm su substrati di CaF₂ in tre ambienti: aria, acqua e una miscela acqua-glicerolo con indice di rifrazione adattato (progettata per eliminare le riflessioni del substrato e simulare un ambiente isotropo 3D).

Contributi Chiave e Risultati
Il lavoro introduce e valida una nuova modalità di imaging denominata Internal Forward Scattering (IFS). L'IFS sfrutta la riflessione posteriore generata sulla superficie superiore del substrato del campione trasparente al MIR come un'onda di illuminazione a scattering frontale generata internamente. Utilizzando il gating della coerenza temporale, questa onda generata internamente viene isolata dal campo retro-diffuso diretto.

• IFS vs. FWS e BWS: In aria e in acqua, l'IFS ha riprodotto le magnitudini del segnale e la dinamica temporale delle misurazioni FWS reali, mantenendo l'accessibilità su un solo lato tipica della BWS. Le immagini di fase e le risposte di fase differenziale in IFS erano quasi identiche alla FWS, mentre le immagini BWS presentavano artefatti come salti di fase improvvisi e distorsioni di forma dovuti all'interferenza distruttiva.
• Dinamica Temporale: Le misurazioni risolte nel tempo hanno rivelato che, sebbene la BWS fornisse la magnitudo del segnale complessivo più elevata (poiché il probe attraversa efficacementamente la microsfera due volte), la FWS e l'IFS hanno fornito profili di fase temporali coerenti e razionalizzabili. In acqua, sia l'IFS che la FWS sono riuscite a catturare la rapida risposta della microsfera e la più lenta espansione termoelastica del mezzo circostante.
• Ambiente con Indice Adattato: Nella miscela acqua-glicerolo con indice di rifrazione adattato, dove le riflessioni del substrato sono state soppresse, la BWS non mostrava alcun segnale di fondo e presentava un segnale della particella spazialmente modulato e complesso a forma di "trifoglio". Al contrario, l'IFS (e la FWS) ha risolto chiaramente sia il segnale localizzato della microsfera che il ampio background del solvente, dimostrando una fedeltà quantitativa superiore in ambienti complessi.

Significato e Rivendicazioni
Gli autori affermano che l'IFS stabilisce un'alternativa pratica e quantitativa alle convenzionali geometrie FWS e BWS per l'imaging fototermico e di fase quantitativa. Il significato di questo lavoro risiede nei seguenti punti:

1. Risoluzione del Compromesso di Accesso: L'IFS combina la sensibilità di fase quantitativa e l'indipendenza dalla forma della FWS con la semplicità meccanica e l'accesso su un solo lato della BWS.
2. Superamento degli Artefatti di Interferenza: Isolando la componente diffusa in avanti tramite il gating della coerenza, l'IFS evita l'interferenza distruttiva dipendente dalla profondità che affligge la BWS per oggetti micrometrici.
3. Ampia Applicabilità: I risultati suggeriscono che l'IFS è particolarmente rilevante per l'imaging su un solo lato di campioni biologici o contenuti in solventi dove l'accesso su due lati è impossibile.
4. Fattibilità di Implementazione: Gli autori osservano che l'IFS può essere implementato utilizzando laser a diodi commerciali con lunghezze di coerenza temporale di 100–200 µm, rendendo la tecnica accessibile.

Il documento conclude che, sebbene la BWS rimanga vantaggiosa per oggetti nanometrici nel regime di Rayleigh, l'IFS è la geometria preferita per l'imaging quantitativo di campioni più grandi o eterogenei in contesti sperimentali vincolati. Gli autori intendono estendere questo approccio a campioni biologicamente rilevanti, come cellule vive e tessuti, per valutarne la robustezza in paesaggi di indice di rifrazione complessi.