Sub-microsecond conformational dynamics in an optical nanocavity

Immaginate di cercare di guardare un ballerino eseguire una routine complessa, ma il ballerino è invisibile, il palco è completamente buio e vi è permesso di sbirciare solo attraverso un buco della serratura per una frazione di secondo. Questo è il problema che gli scienziati affrontano quando cercano di capire come le proteine — le minuscole macchine operanti all'interno di ogni cellula vivente — si muovano e cambino forma. Questi momenti di mutamento di forma sono cruciali; è così che i nostri corpi riconoscono i virus, digeriscono il cibo e inviano segoli tra le cellule. Tuttavia, questi cambiamenti avvengono incredibilmente velocemente, spesso in milioni di millesimi di secondo, e sono così piccoli che i microscopi tradizionali non riescono a vederli senza applicare etichette luminose e brillanti alle proteine. Ma ecco il problema: quelle etichette possono agire come zaini pesanti, rallentando il ballerino o cambiandone le mosse, rendendo l'osservazione imprecisa. Inoltre, poiché le proteine sono così frenetiche, muovendosi casualmente come una foglia in una tempesta (un fenomeno chiamato moto browniano), è stato quasi impossibile tracciare i passi specifici della danza di una singola proteina senza perdersi nel rumore.

Entrate ora in scena un team di ricercatori che ha costruito una telecamera super-sensibile e ad alta velocità che non ha bisogno di etichettare affatto il ballerino. Hanno creato un minuscolo sensore a fibra ottica che funge da palco super-silenzioso e ultra-stabile. Invece di cercare di congelare la proteina in posizione con forze forti che potrebbero schiacciarla, la guidano delicatamente su una superficie dove può muoversi liberamente ma rimanere visibile. Questo nuovo dispositivo è così veloce e stabile da poter osservare una singola proteina che cambia forma in meno di un milionesimo di secondo, catturando migliaia di questi minuscoli "passi" in un unico film continuo che dura minuti. Facendo questo, hanno scoperto che le proteine non si muovono solo in modo casuale; hanno memoria, esitano e passano da una forma all'altra in modi che prima erano nascosti perché gli scienziati guardavano solo la media di milioni di proteine contemporaneamente. Questo apre una nuova finestra sulla danza segreta e rapida della vita, aiutandoci a capire come queste macchine molecolari funzionano quando sono sane e cosa succede quando malfunzionano.

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La telecamera super-sensibile per le proteine

I ricercatori, guidati da Heehun Sung e Warwick Bowen dell'Università del Queensland, hanno sviluppato un nuovo tipo di sensore per guardare le proteine danzare senza toccarle. Pensate al loro dispositivo come a una minuscola "fessura" unidimensionale incisa in un chip di silicio, che agisce come una lente d'ingrandimento super potente per la luce. Quando la luce viene intrappolata in questa fessura, crea un campo molto uniforme e delicato.

Di solito, quando gli scienziati cercano di intrappolare una singola proteina per osservarla, il campo luminoso è come una collina irregolare e sconnessa. La proteina viene spinta e tirata da queste asperità, oscillando selvaggiamente a causa del suo naturale movimento indotto dal calore (moto browniano). Questo tremolio crea così tanto rumore da sommergere i minuscoli e significativi cambiamenti nella forma della proteina. Gli autori hanno capito che, per vedere i veri movimenti della proteina, avevano bisogno di appiattire la collina. Hanno progettato la loro fessura di silicio in modo che il campo luminoso sia incredibilmente liscio e uniforme. Questa levigatezza sopprime il tremolio della proteina di un fattore sessanta, silenzendo efficacemente il rumore di fondo in modo che i reali cambiamenti strutturali della proteina possano essere uditi chiaramente.

La ballerina Ferritina

Per testare il loro nuovo sensore, hanno utilizzato una proteina chiamata ferritina, che è essenzialmente una minuscola gabbia di stoccaggio del ferro presente nei nostri corpi. Hanno posizionato un singolo strato di queste proteine sul loro sensore e hanno osservato cosa accadeva.

Per prima cosa, hanno visto le proteine attaccarsi alla superficie, formando uno "strato duro". Una volta che questo strato è diventato stabile, hanno osservato singole proteine debolmente attaccate ad esso. Queste proteine non erano bloccate strettamente; si trovavano in uno "strato morbido", che permetteva loro di oscillare e spostarsi pur rimanendo in un punto.

Il sensore ha rilevato qualcosa di incredibile: le proteine compiono "passi" distinti tra due diverse forme. Non si tratta di uno scivolamento fluido; è un salto improvviso da uno stato all'altro.

• La Velocità: Potevano risolvere questi salti in soli 400 nanosecondi (ovvero 0,0000004 secondi).
• Il Volume: In una singola misurazione durata solo 8,5 secondi, hanno tracciato oltre 71.000 transizioni (passi) per una singola proteina. In una misurazione di 1 secondo di un altro tipo, hanno visto oltre 12.000 passi.

Questo livello di dettaglio era precedentemente impossibile. I metodi più vecchi potevano vedere solo la media di milioni di proteine, il che sfocava questi rapidi passi individuali.

Cosa ci dicono i passi

Osservando questi passi in tempo reale, i ricercatori hanno scoperto che le proteine hanno la "memoria".

• Effetti di Memoria: Quando la proteina rimaneva in una forma per un po', il suo movimento successivo dipendeva da quanto tempo era rimasta lì. Ciò suggerisce che la struttura interna della proteina si sta lentamente spostando sullo sfondo, influenzando i suoi movimenti attuali.
• Eterogeneità: Non tutte le proteine erano uguali. Anche all'interno dello stesso lotto, alcune proteine si muovevano diversamente da altre. Questa "individualità" era nascosta negli studi precedenti che facevano la media di tutto.

Hanno anche testato come l'ambiente cambia la danza:

1. Concentrazione Salina: Quando hanno aumentato il sale nella soluzione, il "passo" della proteina è cessato e la proteina si è stabilizzata in un'unica forma. Ciò suggerisce che il sale agisce come un stabilizzatore, bloccando la sua struttura esterna in posizione.
2. Il Nucleo di Ferro: Hanno confrontato la ferritina con il suo nucleo di ferro (holoferritina) e la ferritina senza il nucleo (apoferritina). La versione senza il nucleo era meno stabile e continuava a compiere i "passi" anche con livelli di sale elevati. Questo ha confermato che il nucleo di ferro aiuta a irrigidire la struttura della proteina.

Perché questo è importante

Gli autori sostengono che questi rapidi passi siano probabilmente la proteina che apre e chiude i suoi minuscoli canali per far entrare e uscire il ferro — un processo che le simulazioni avevano previsto, ma che nessuno era riuscito a vedere effettivamente fino ad ora. Poiché il loro sensore è costruito su un chip di silicio, possono produrne centinaia alla volta. Ciò significa che la tecnologia potrebbe in futuro essere scalata per esaminare migliaia di farmaci o studiare come diverse proteine interagiscono, il tutto senza la necessità di etichette fluorescenti che potrebbero alterare il comportamento naturale della proteina.

I ricercatori sottolineano con cautela che, sebbene siano molto fiduciosi che questi passi rappresentino il cambiamento di forma della proteina, stanno ancora lavorando per escludere altre possibilità, come il semplice salto della proteina in un altro punto del sensore. Tuttavia, il fatto che i passi dipendano dai livelli di sale e dalla presenza del nucleo di ferro, e che altre proteine come la catalasi non abbiano mostrato lo stesso comportamento di "passo", supporta fortemente l'idea che stiano osservando il cambiamento della struttura interna della proteina.

Questo lavoro non ci fornisce solo una telecamera più veloce; ci offre un nuovo modo per ascoltare le conversazioni silenziose e rapide delle molecole che ci tengono in vita.