Circular Dichroism Spectroscopy of Single Objects: Problems, Artifacts, and Corrections

La luce trasporta molto più della semplice energia; trasporta una torsione. Quando un fascio di luce viaggia in avanti, il suo campo elettrico può ruotare come un tappo di bottiglia, girando verso sinistra o verso destra mentre si muove. Questa proprietà, nota come polarizzazione circolare, interagisce in modo diverso con determinate molecole a seconda della direzione di questa rotazione. Alcune strutture molecolari, in particolare quelle presenti nell'intricato macchinario della fotosintesi, assorbono la luce che ruota a sinistra più facilmente di quella che ruota a destra, o viceversa. Questa differenza, chiamata dicroismo circolare, funge da impronta digitale per la forma tridimensionale di queste molecole. Misurando quanto più di un tipo di luce rotante venga assorbito da un campione rispetto all'altro, gli scienziati possono dedurre l'architettura di complessi assemblaggi biologici senza doverli congelare in cristalli.

Tuttavia, cercare di misurare questo effetto sottile su un singolo, minuscolo oggetto — come un singolo' unità di raccolta della luce di un batterio — è un esercizio di estrema precisione. In un grande gruppo di molecole, le orientazioni casuali e gli effetti di media smorzano molti degli errori di misurazione. Ma quando si osserva un solo oggetto, la misurazione diventa incredibilmente sensibile alla minima imperfezione della luce stessa. Se la luce destinata ad essere perfettamente rotante a sinistra è anche solo leggermente fuori centro, o se contiene una piccola, indesiderata scheggia di polarizzazione lineare, lo strumento può registrare un segnale falso. Questo segnale falso può facilmente sommergere il reale segnale strutturale, rendendo impossibile capire se la molecola sia veramente chirale o se la macchina stia semplicemente mentendo.

Un team di ricercatori dell'Università di Bayreuth ha sviluppato un metodo rigoroso per risolvere questo problema, permettendo loro di misurare il dicroismo circolare di singoli aggregati molecolari con un'affidabilità senza precedenti. Il loro lavoro si concentra su un tipo specifico di struttura biologica chiamata clorosoma, presente nei batteri verdi solforati. Questi sono enormi tubi auto-assemblati di molecole di pigmento che agano come altamente efficienti collettori di luce. Poiché queste strutture sono così grandi e complesse, e poiché variano da una all'altra, studiarle una per una offre una finestra unica su come la natura costruisce i suoi pannelli solari. La sfida era che i precedenti tentativi di misurare questi singoli oggetti erano inficiati da artefatti — errori causati dall'apparato sperimentale piuttosto che dal campione stesso. I ricercatori hanno capito che, per vedere il vero segnale, dovevano prima comprendere ed eliminare ogni possibile modo in cui la loro attrezzatura potesse ingannarli.

Il cuore della loro soluzione risiede nel modo in cui generano e controllano la luce rotante. Utilizzano un dispositivo chiamato cella di Pockels, ovvero un cristallo che cambia le proprie proprietà ottiche quando viene applicata una tensione elettrica. Cambiando rapidamente la tensione, possono invertire la luce da rotante a sinistra a rotante a destra migliaia di volte al secondo. Tuttavia, questo cristallo non è perfetto. Se il cristallo non è allineato con assoluta precisione, o se la tensione non è esattamente quella corretta, la luce risultante non è un cerchio perfetto ma un ovale, o ellisse, leggermente schiacciato. Inoltre, il fascio di luce potrebbe spostarsi leggermente a sinistra quando ruota a sinistra e a destra quando ruota a destra. Per un singolo, minuscolo oggetto posto nel fascio, questo spostamento significa che viene colpito da quantità diverse di luce a seconda della direzione di rotazione, creando una falsa differenza di assorbimento che sembra dicroismo circolare ma è in realtà solo uno squilibrio di intensità.

Per risolvere questo problema, il team ha trattato la questione come un puzzle di calibrazione. Hanno mappato esattamente come l'allineamento del cristallo e la tensione applicata influenzassero la forma e la posizione del fascio di luce. Hanno scoperto che gli errori potevano essere suddivisi in due categorie principali: errori di intensità, dove la quantità di luce che colpisce il campione cambia, ed errori di polarizzazione, dove la qualità della rotazione cambia. Hanno scoperto che questi errori non erano casuali; seguivano schemi prevedibili basati su come il cristallo veniva inclinato o su come la tensione veniva regolata. Misurando attentamente la posizione e la forma del fascio a diverse impostazioni, potevano calcolare esattamente quanto errore veniva introdotto in ogni punto dello spettro.

I ricercatori hanno quindi sviluppato una procedura passo dopo passo per allineare il cristallo e regolare le tensioni al fine di minimizzare questi errori. Hanno regolato l'inclinazione e la posizione del cristallo finché il fascio non si spostava il meno possibile tra i due stati di rotazione. Hanno anche compensato altri elementi ottici nel loro setup, come le finestre di vetro del criostato dove i campioni vengono mantenuti freddi, che possono anche torcere leggermente la luce. Ruotando queste finestre ad angoli specifici, potevano annullare gli effetti di torsione indesiderati. Attraverso questo meticoloso processo, hanno ridotto gli errori potenziali a un livello in cui il "rumore" rimanente era inferiore all'uno percento del segnale che stavano cercando di misurare. Questo livello di controllo significava che, quando vedevano una differenza di assorbimento, potevano essere certi che provenisse dalla molecola stessa e non dalla macchina.

Con il sistema calibrato, il team ha rivolto la sua attenzione ai clorosomi. Ha posizionato i singoli clorosomi all'interno di una camera a vuoto raffreddata a temperature criogeniche per evitare che si muovessero o si degradassero. Ha poi scansionato la luce attraverso un intervallo di colori, dal rosso intenso al vicino infrarosso, registrando la fluorescenza emessa da ogni singolo oggetto mentre alternava la rotazione della luce. I risultati sono stati chiari e distinti. Sono riusciti a registrare gli spettri di dicroismo circolare di singoli clorosomi, rivelando le uniche firme strutturali di queste minuscole macchine biologiche. I dati hanno mostrato che, anche all'interno di un singolo campione, diversi clorosomi avevano forme e disposizioni interne leggermente differenti, un livello di dettaglio che sarebbe stato completamente nascosto se avessero misurato l'intero gruppo di batteri contemporaneamente.

Questo lavoro fa molto di più che fornire un nuovo modo per osservare i batteri; stabilisce un nuovo standard per come misurare le sottili proprietà ottiche di singoli oggetti. I ricercatori hanno dimostrato che, caratterizzando e correggendo rigorosamente le imperfezioni della loro sorgente luminosa, potevano estrarre informazioni strutturali affidabili dai bersagli più piccoli possibili. Hanno dimostrato che la paura degli artefatti, che precedentemente aveva limitato l'uso del dicroismo circolare su singoli oggetti, poteva essere superata attraverso una cura ingegneristica e una correzione matematica. Le loro scoperte confermano che è possibile sondare l'architettura tridimensionale di singoli assemblaggi supramolecolari, aprendo la porta alla comprensione di come la natura costruisce i suoi sistemi di raccolta della luce più efficienti, una molecola alla volta. Lo studio funge da guida pratica per altri nel campo, provando che con l'approccio corretto, il rumore dello strumento può essere messo a tacere per rivelare la silenziosa verità della molecola.