Structural basis for co-translational assembly of homo-oligomeric proteins in cis and in trans

All'interno di ogni cellula vivente, minuscole macchine chiamate ribosomi agiscono come le fabbriche della vita, leggendo le istruzioni genetiche per costruire le proteine. Queste proteine sono i cavalli di battaglia della cellula, ma raramente lavorano da sole. Per funzionare, devono spesso incastrarsi con altre proteine per formare strutture complesse, proprio come gli ingranaggi individuali che si agganciano in un meccanismo a orologeria. Per decenni, gli scienziati hanno creduto che queste connessioni avvenissero solitamente dopo che una proteina era stata completamente costruita e rilasciata nella cellula. Tuttavia, ricerche recenti hanno rivelato che molte proteine iniziano ad assemblarsi con i loro partner mentre vengono ancora costruite, un processo noto come assemblaggio co-traduzionale. Questa connessione precoce aiuta a prevenire che le proteine si aggroviglino o si degradino nel congestionato ambiente cellulare. Una domanda fondamentale è rimasta aperta: quando due proteine identiche devono unire le forze, si trovano mentre vengono costruite sullo stesso filamento di materiale genetico, o raggiungono i partner che vengono costruiti su filamenti completamente diversi nelle vicinanze?

Un team di ricercatori del Centro di Biologia Molecolare dell'Università di Heidelberg ha ora risposto a questa domanda per una specifica proteina batterica chiamata PheA. Utilizzando tecniche di imaging avanzate e strumenti genetici, hanno scoperto che questa proteina ignora ampiamente la regola secondo cui l'assemblaggio avviene sullo stesso filamento genetico. Al contrario, hanno scoperto che le molecole di PheA si assemblano frequentemente raggiungendo i partner che vengono costruiti su filamenti di materiale genetico separati e vicini. Questa scoperta rivela un livello sorprendente di organizzazione nella cellula batterica, dove i ribosomi su diverse istruzioni genetiche si collegano fisicamente per formare vaste reti interconnesse che garantiscono che queste proteine siano costruite correttamente ed efficientemente.

I ricercatori si sono concentrati su PheA, un enzima a due parti presente nei batteri E. coli che aiuta la cellula a produrre un nutriente vitale. Questo enzima è composto da due metà identiche che devono ruotare l'una attorno all'altra per funzionare. Gli scienziati sapevano che se queste metà non si fossero unite immediatamente dopo che una sezione specifica della proteina fosse emersa dal ribosoma, la proteina sarebbe probabilmente mal ripiegata e diventata inutile. Per capire come avviene questo unione, il team ha prima osservato il comportamento dei ribosomi nella cellula. Hanno utilizzato un metodo per separare i cluster pesanti di ribosomi da quelli più leggeri e hanno scoperto che, quando la PheA viene prodotta in grandi quantità, i ribosomi formano enormi ammassi pesanti che affondano sul fondo delle provette utilizzate per i test, dimostrando che i ribosomi erano tenuti insieme dalle catene proteiche in crescita stesse, piuttosto che fluttuare casualmente.

Per vedere esattamente come queste catene si connettessero, il team ha sviluppato un esperimento ingegnoso utilizzando due versioni leggermente diverse del gene PheA. Hanno posizionato questi due geni su filamenti genetici separati all'interno della stessa cellula. Una versione della proteina era contrassegnata con un'etichetta specifica, l'altra con un'etichetta diversa. Quando hanno estratto le proteine con la prima etichetta, hanno scoperto che la seconda versione della proteina era attaccata ad essa. Questo ha fornito la prova diretta che le due metà dell'enzima si stavano unendo anche se venivano costruite da istruzioni genetiche completamente diverse. Ciò significava che l'assemblaggio stava avvenendo in trans, ovvero attraverso diversi filamenti genetici, piuttosto che in cis, ovvero sullo stesso filamento.

Il team ha poi utilizzato una potente tecnica di imaging chiamata criomicroscopia elettronica per visualizzare i ribosomi stessi. Hanno congelato i ribosomi in un sottile strato di ghiaccio e hanno scattato migliaia di immagini ad alta risoluzione per vedere come fossero disposti. Hanno misurato la distanza tra i tunnel di uscita dei ribosomi, i minuscoli fori da cui emergono le nuove catene proteiche. Hanno scoperto che, durante la costruzione della PheA, i ribosomi si posizionano in modo che questi tunnel di uscita siano molto vicini tra loro, circa 120 angstrom. Questa prossimità permette alle catene proteiche emergenti di toccarsi e incastrarsi quasi immediatamente. Sorprendentemente, le immagini hanno mostrato che questi ribosomi non avevano un'orientazione fissa; potevano ruotare e muoversi liberamente finché i loro tunnel di uscita rimanevano vicini. Questa flessibilità suggeriva che i ribosomi non fossero bloccati in una formazione rigida, ma si stessero trovando dinamicamente per facilitare la connessione.

Quando i ricercatori hanno esaminato i ribosomi sui filamenti genetici intatti, hanno scoperto che la stretta prossimità dei tunnel di uscita avveniva più spesso tra ribosomi su filamenti diversi. Sebbene fosse possibile che i ribosomi sullo stesso filamento si connettessero, ciò era raro e richiedeva solitamente che il filamento genetico si ripiegasse su se stesso affinché i ribosomi distanti potessero raggiungersi. I vicini diretti sullo stesso filamento erano in realtà troppo lontani per connettere le loro proteine emergenti. Questa scoperta ha sfidato l'idea prevalente secondo cui le proteine identiche si assemblano solitamente sullo stesso filamento genetico. Inveve, per la PheA, la cellula si affida a una rete di diversi filamenti genetici che si uniscono.

I ricercatori hanno spiegato che questa preferenza per la connessione attraverso diversi filamenti è probabilmente dovuta alla velocità con cui la PheA deve assemblarsi. La parte della proteina che deve unirsi al suo partner è molto corta ed emerge rapidamente. Se i ribosomi fossero rimasti bloccati sullo stesso filamento, la geometria del materiale genetico costringerebbe i tunnel di uscita a essere troppo distanti affinché le proteine si connettano in tempo. Permettendo ai ribosomi su diversi filamenti di avvicinarsi, la cellula crea un ambiente flessibile in cui le proteine possono trovarsi istantaneamente. Questo meccanismo assicura che l'enzima sia costruito correttamente senza sprecare energia o creare parti difettose.

Questo studio fornisce una visione chiara di come le cellule organizzano la costruzione di macchine complesse. Mostra che la cellula non si affida a un unico metodo rigido per assemblare le proteine. Inveve, utilizza la prossimità fisica dei ribosomi, indipendentemente da quale filamento genetico si trovino, per garantire che le proteine trovino i loro partner al momento esatto. Per la PheA, ciò significa che la cellula costruisce una rete dinamica di ribosomi, collegando diverse istruzioni genetiche per risolvere un problema strutturale. Questa scoperta suggerisce che l'interno affollato di una cellula non è solo un mix caotico di parti, ma uno spazio altamente organizzato dove la disposizione fisica dei macchinari è tarata sulle specifiche esigenze delle proteine in fase di produzione.