Genomic Profiling of Estrogen-Related Receptor Identifies Adult Adipocyte-Specific Targets in Drosophila

Descrizione del Problema
Il tessuto adiposo è un organo metabolico critico responsabile dell'accumulo di energia e della mobilizzazione dei lipidi. La famiglia dei recettori correlati all'estrogeno (ERR), una classe di recettori nucleari, è un noto regolatore del metabolismo glicolitico e lipidico in molte specie, inclusa Drosophila. Studi precedenti hanno stabilito che la perdita di ERR nell'intero organismo in Drosophila porta a una diminuzione della trascrizione degli enzimi della glicolisi e della via dei pentoso fosfati (PPP) e a una riduzione dell'accumulo di lipidi. Tuttavia, rimaneva una lacuna critica: non era chiaro se i cambiamenti osservati nell'espressione dell'mRNA fossero dovuti alla regolazione diretta di questi geni da parte di ERR all'interno di tipi cellulari specifici. Inoltre, i target specifici per tipo cellulare di ERR nel tessuto adiposo adulto non erano stati pienamente elucidati, data la natura del corpo grasso di Drosophila, che è un tessuto composto che contiene sia adipociti che oenociti simili a epatociti, rendendo insufficiente l'analisi del tessuto totale per identificare eventi di legame specifici per l'adipocita.

Metodologia
Per affrontare la sfida di identificare i target dei fattori di trascrizione in tipi cellulari specifici senza richiedere grandi dissezioni di tessuti o anticorpi specifici, gli autori hanno impiegato un approccio NanoDam, una versione modificata della tecnica mirata DamID.

• Sistema Genetico: Lo studio ha utilizzato una proteina ERR con un tag GFP all'estremità C-terminale endogeno (ERR::eGFSTF) incrociata con un transgene UAS-NanoDam. Il costrutto NanoDam consiste in una DNA metiltransferasi fusa a un nanobody GFP.
• Specificità per Tipo Cellulare: L'espressione di NanoDam è stata limitata agli adipociti adulti utilizzando il driver 3.1Lsp2-Gal4, controllato da un sistema tubGal80ts termosensibile. Le mosche sono state allevate a 18°C (temperatura permissiva per Gal80ts, che impedisce la metilazione) e spostate a 29°C per 14 ore in età adulta per indurre l'espressione di NanoDam specificamente negli adipociti.
• Generazione dei Dati: La metilazione dell'adenina avviene solo dove il NanoDam e l'ERR endogeno si sovrappongono. Il DNA genomico è stato estratto, il DNA metilato è stato arricchito e le librerie sono state sequenziate su una piattaforma Illumina NextSeq2000.
• Analisi: Le letture (reads) sono state mappate sul genoma di Drosophila (r6.42). I frammenti DpnI differenzialmente abbondanti (che indicano il legame di ERR) sono stati identificati tramite DESeq2, con significatività definita da un valore P aggiustato < 0,05 e un log2 fold change ≥ 2. L'arricchimento dei termini di Gene Ontology e dei pathway è stato eseguito tramite PANGEA.

Contributi Chiave e Risultati
Lo studio ha mappato con successo l'occupanza di ERR specificamente negli adipociti maschi e femmine, identificando oltre 900 siti di legame in entrambi i sessi.

• Profilo di Legame Globale: ERR-NanoDam ha identificato oltre 950 regioni genomiche (che rappresentano >1.000 geni unici) nelle femmine e 1.580 regioni (1.480 geni unici) nei maschi. Circa 925 geni erano comuni a entrambi i sessi.
• Arricchimento dei Pathway: I siti di legame comuni erano significativamente arricchiti per i pathway metabolici, specificamente il metabolismo dei carboidrati, il metabolismo del glicogeno, la glicolisi, la biosintesi del trealosio e la via dei pentoso fosfati (PPP).
• Glicolisi: È stato scoperto che ERR si lega ai loci che codificano per sette dei 13 enzimi glicolitici in entrambi i sessi. Sebbene siano state note alcune differenze specifiche per sesso (i maschi mostravano un maggiore legame per Pgi, Gapdh1 e Gapdh2), il set centrale di target glicolitici era conservato. Questi eventi di legame si sovrapponevano ampiamente ai geni sottoregolati negli studi precedenti di knockout di ERR nell'intero organismo.
• Via dei Pentoso Fosfati (PPP): ERR si è legato a quattro degli otto enzimi della PPP (Pgls, Rpe, Tkt, Taldo) in entrambi i sessi. Significativamente, Zw (che codifica per G6PD), che è sottoregolato nei mutanti ERR, non era legato da ERR negli adipociti, suggerendo che possa essere regolato indirettamente o in altri tessuti.
• Gluconeogenesi: ERR si è legato a tre dei quattro geni enzimatici della gluconeogenesi e al gene del trasportatore del trealosio (Tret1). Tuttavia, non si è legato al locus Fbp.
• Beta-Ossidazione: ERR si è legato a sei degli 11 geni coinvolti nella beta-ossidazione degli acidi grassi. Quattro di questi (CG5321, CG3902, scully, yip2) erano anche sottoregolati negli adipociti larvali mutanti per ERR.
• Dimorfismo Sessuale: Sebbene un set centrale di target metabolici fosse condiviso, lo studio ha osservato un arricchimento specifico per sesso. Il legame di ERR nei maschi era arricchito per i geni del metabolismo degli acidi grassi e dei carboidrati, mentre il legame nelle femmine mostrava un arricchimento per i geni del metabolismo del glicogeno e dei carboidrati.

Significatività e Rivendicazioni
L'articolo afferma che ERR funziona centralmente nel tessuto adiposo per regolare molteplici pathway metabolici, inclusi la glicolisi, la PPP e l'ossidazione degli acidi grassi. La principale significatività di questo lavoro risiede nel dimostrare che il profiling genomico specifico per tipo cellulare (NanoDam) può identificare i target trascrizionali diretti che sono oscurati nelle analisi RNA-seq bulk di interi organismi o di campioni di tessuti misti. I risultati predicono che l'attività di ERR è necessaria specificamente negli adipociti di entrambi i sessi per mantenere l'omeostasi energetica. Gli autori concludono che i target di ERR sono probabilmente dimorfici per sesso e possono variare in base allo stadio di sviluppo, rafforzando il ruolo conservato di ERR nella regolazione del metabolismo energetico tra le specie, evidenziando al contempo la necessità di un'analisi specifica per tessuto per comprendere appieno la regolazione trascrizionale.