Mechanism and regulation of Bim1 interactions withthe S. cerevisiae outer kinetochore Ndc80 complex
Questo studio rivela che la proteina di tracciamento dell'estremità più dei microtubuli Bim1 interagisce con il complesso Ndc80 di S. cerevisiae tramite un motivo conservato SxIP e un sito elicoidale secondario per rafforzare gli attacchi ai microtubuli, un processo che è regolato dalla fosforilazione mediata dalla chinasi Ipl1/Aurora B per facilitare la destabilizzazione delle connessioni errate cinetocore-microtubulo durante la correzione degli errori.
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All'interno di ogni cellula in divisione, una macchina microscopica lavora con implacabile precisione per garantire che il materiale genetico venga copiato e diviso equamente tra due nuove cellule figlie. Questa macchina si affida a una struttura chiamata cinetocore, un grande complesso proteico che si assembla sul cromosoma e funge da gancio, agganciandosi a lunghe fibre simili a fili chiamate microtubuli. Queste fibre formano un fuso che tira i cromosomi separandoli. Affinché questo processo funzioni senza errori, il cinetocore deve aggrapparsi con sufficiente forza da resistere alla forza di trazione, pur rimanendo abbastanza flessibile da lasciare la presa se aggancia la fibra sbagliata. Le cellule possiedono un sistema di controllo qualità integrato, guidato da un enzima specifico, che può indebolire questi collegamenti se non sono perfettamente allineati, permettendo alla cellula di riprovare. Sebbene gli scienziati conoscano da tempo le parti principali di questo gancio e delle fibre che esso aggancia, non hanno compreso appieno come altre proteine ausiliarie assistano in questo delicato equilibrio o come il sistema di controllo qualità della cellula perfezioni queste interazioni.
Un team di ricercatori presso il MRC Laboratory of Molecular Biology di Cambridge ha scoperto ora una connessione precedentemente nascosta tra due attori chiave in questo processo: una proteina chiamata Bim1 e la componente principale di aggancio del cinetocore, nota come complesso Ndc80. Bim1 è una proteina specializzata che cerca naturalmente le estremità in crescita dei microtubuli, agendo come un esploratore che segna la fine della fibra. Il complesso NdC80 è la struttura primaria che attacca fisicamente il cromosoma a quella fibra. I ricercatori hanno scoperto che Bim1 non si limita a pendere dall'estremità del microtubulo; essa raggiunge anche l'esterno e si lega direttamente al complesso Ndc80. Questo legame non è una collisione casuale, ma una stretta di mano specifica mediata da una breve sequenza conservata di amminoacidi sulla proteina Ndc80. Lo studio rivela che questa interazione è rafforzata da un secondo punto di contatto meno ovvio, creando un legame più stabile che aiuta il cinetocore a trattenere il microtubulo con maggiore forza.
Per trovare questa connessione, gli scienziati hanno mescolato versioni purificate di queste proteine in una provetta e hanno osservato come si comportassero. Hanno osservato che quando Bim1 e il complesso Ndc80 venivano combinati, restavano uniti, formando un'unità più grande che si muoveva diversamente attraverso un gel rispetto alle singole proteine. Utilizzando una tecnica che misura il calore rilasciato quando le molecole si legano, hanno determinato che la connessione è relativamente debole, il che è in realtà una caratteristica piuttosto che un difetto. Questa forza moderata permette alle proteine di associarsi e dissociarsi rapidamente, un tratto necessario per l'ambiente dinamico di una cellula in divisione. I ricercatori hanno poi utilizzato l'imaging avanzato e la modellazione computerizzata per vedere esattamente come si incastrano tra loro. Hanno scoperto che la presa primaria è formata da un motivo specifico della proteina Ndc80, ma questa presa da sola non è sufficiente a spiegare la forza del legame. Una seconda regione della proteina Ndc80, che forma una piccola forma elicoidale, avvolge la proteina Bim1 per fornire ulteriore stabilità. Questo attaccamento a doppio punto è ciò che permette al complesso di funzionare efficacementamente nella cella.
Lo studio ha anche esplorato come il sistema di correzione degli errori della cellula influenzi questa connessione. L'enzima responsabile del controllo degli errori, noto come Ipl1, aggiunge etichette chimiche chiamate fosfati a punti specifici sulla proteina Ndc80. I ricercatori hanno scoperto che quando queste etichette vengono aggiunte, la forma della proteina Ndc80 cambia leggermente e la sua capacità di trattenere Bim1 si indebolisce significamente. Ciò suggerisce un meccanismo chiaro su come la cellula possa allentare un attaccamento difettoso: modificando la proteina Ndc80, la cellula riduce la presa della proteina ausiliaria Bim1, rendendo più facile la rottura e il reset della connessione. Questa scoperta fornisce un nuovo livello di comprensione su come le cellule assicurino la corretta separazione dei cromosomi, prevenendo il caos genetico che può portare a malattie.
In un ultimo set di esperimenti, il team ha testato se questa interazione aiuti effettivamente il cinetocore a trattenere il microtubulo sotto stress fisico. Utilizzando una trappola ottica altamente sensibile che agisce come un paio di pinzette microscopiche, hanno misurato la forza necessaria per staccare il complesso Ndc80 da un microtubulo. Hanno scoperto che, in presenza di Bim1, la connessione poteva sopportare una forza significativamente maggiore prima di rompersi. Tuttavia, quando hanno testato una versione della proteina Ndc80 che non poteva legarsi a Bim1, la connessione era più debole. Ciò ha confermato che l'interazione tra Bim1 e Ndc80 rafforza direttamente l'attacco tra il cromosoma e la fibra del fuso. Interessante è che i ricercatori hanno anche scoperto che questo effetto di rafforzamento non si combina con un'altra proteina ausiliaria chiamata Dam1 per creare un legame ancora più forte; invece, sembrano operare attraverso percorsi separati o competere per lo stesso spazio.
I ricercatori hanno anche osservato cosa accade all'interno delle cellule di lievito viventi per vedere se questa interazione sia essenziale per la vita. Hanno creato ceppi di lievito in cui la capacità di Ndc80 di legarsi a Bim1 è stata interrotta, sia rimuovendo il sito di legame sia mimando la fosforilazione che indebolisce il legame. Sorprendentemente, queste cellule di lievito crescevano e si dividevano normalmente, suggerendo che, sebbene questa interazione aiuti a rafforzare la connessione, non è strettamente necessaria per la sopravvivenza della cellula. Ciò implica che il legame Bim1-Ndc80 funge da meccanismo di supporto, forse aiutando a stabilire la connessione iniziale o fornendo sicurezza extra durante le prime fasi della divisione, piuttosto che essere l'unico fondamento del processo. Il lavoro evidenzia la complessità del macchinario cellulare, mostrando come anche sistemi ben studiati come la segregazione dei cromosomi dipendano da una rete di interazioni sottili e regolate che gli scienziati stanno solo iniziando a mappare.
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