PURELIGHT: a quantitative photon-counting framework unifying intensity and lifetime imaging at video rate across detector technologies
Il documento introduce PURELIGHT, un framework hardware e software unificato che elimina le distorsioni da pile-up dei fotoni nel conteggio di singoli fotoni correlati nel tempo, consentendo la microscopia a fluorescenza quantitativa a velocità video con misurazioni accurate di intensità e tempo di vita attraverso diverse tecnologie di rilevamento.
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Nel mondo della ricerca biologica, gli scienziati hanno spesso bisogno di vedere il meccanismo invisibile della vita che lavora all'interno di una cella vivente. Per farlo, utilizzano una tecnica chiamata microscopia a fluorescenza, in cui minuscole molecole vengono marcate con coloranti speciali che brillano quando colpiti dalla luce. Questo bagliore fornisce due informazioni cruciali: quanto sia intensa la luce, il che indica ai ricercatori quanti sono presenti i componenti, e quanto duri il bagliore dopo che l'impulso luminoso ha colpito la molecola, il che rivela l'ambiente chimico circostante. Per decenni, il modo più preciso per misurare entrambi questi elementi contemporaneamente è stato un metodo che conta i singoli particelle di luce, una per una. Tuttavia, questo metodo ha un limite di velocità rigoroso. Se troppe particelle di luce arrivano al rilevatore nello stesso momento, il sistema si confonde e inizia a perdere dati o a registrare informazioni false. Questo collo di bottiglia ha costretto gli scienziati a scegliere tra misurazioni lente e attente o misurazioni veloci e sfocate, escludendo di fatto l'imaging ad alta velocità e alta precisione da molti processi biologici dinamici.
Un team di ricercatori ha introdotto un nuovo framework chiamato PURELIGHT che rompe questo limite di velocità. Questo sistema combina nuovo hardware e software per risolvere la confusione che avviene quando troppe particelle di luce arrivano contemporaneamente, un problema noto come "photon pile-up" (accumulo di fotoni). Invece di scartare la luce in eccesso o accettare dati distorti, il nuovo framework districa matematicamente i segnali per recuperare la vera luminosità e la vera durata del bagliore, anche quando la luce arriva a ritmi molto superiori a quelli che i sistemi precedenti potevano gestire. I ricercatori hanno dimostrato che questo approccio funziona su diversi tipi di apparecchiature di rilevamento della luce, inclusi fotodiodi ibridi, fotomoltiplicatori al silicio e tubi fotomoltiplicatori. Conservando più particelle di luce che precedentemente venivano perse, il sistema trattiene oltre tre volte più fotoni rispetto ai metodi di correzione alternativi, permettendo un'immagine molto più chiara e accurata dell'attività biologica.
La potenza di questo nuovo framework è stata testata utilizzando una potente tecnica di imaging che utilizza due fasci di luce per vedere in profondità all'interno dei tessuti viventi. In questi esperimenti, i ricercatori sono stati in grado di catturare immagini a velocità video di strutture subcellulari all'interno dei cervelli di topi svegli. Ciò significa che hanno potuto osservare le minuscole parti delle cellule che cambiano il proprio ambiente chimico in tempo reale, qualcosa che era precedentemente impossibile con questo livello di precisione. Il sistema ha inoltre consentito un modo unico per misurare i rapporti tra diversi segnali senza interferenze e ha permesso l'invio e la ricezione di molteplici segnali basati sul tempo senza mescolarli. Rimuovendo le barriere di velocità che avevano confinato questo tipo di misurazione precisa a situazioni lente e a bassa luminosità, i ricercatori hanno aperto la porta all'uso più ampio della microscopia quantitativa in tutte le scienze della vita, permettendo agli scienziati di osservare i movimenti rapidi e complessi della vita con una chiarezza che prima era fuori portata.
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