Negative supercoiling facilitates human TOP3α-mediated decatenation of DNA braids via catenation junction melting
Questo studio dimostra che la superavvolgimento negativo facilita la decatenazione di trecce di DNA mediata da TOP3α umana inducendo la fusione locale del duplex nei nodi di incrocio, generando così substrati di DNA a singolo filamento accessibili alla topoisomerasi di tipo IA e ai suoi partner regolatori.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Ogni volta che una cellula si divide, deve fare una copia esatta del suo codice genetico, una lunga scala a pioli ritorta, il DNA. Mentre il macchinario di copia si muove lungo il filamento, crea una nuova coppia di scale che inizialmente sono intrecciate, come due fili di una corda che sono stati attorcigliati insieme. Prima che la cellula possa dividersi in due, questi filamenti aggrovigliati devono essere completamente districati. Se rimangono legati, i cromosomi non possono separarsi e la cellula non può dividersi correttamente. Per decenni, gli scienziati hanno creduto che solo una specifica classe di enzimi, noti come topoisomerasi di tipo II, potesse compiere questo lavoro pesante. Questi enzimi lavorano come forbici molecolari che tagliano entrambi i filamenti della scala di DNA, fanno passare l'altro filamento attraverso la fessura e poi richiudono il taglio. Questo meccanismo di taglio del doppio filamento sembrava essenziale per districare due molecole di DNA a doppio filamento completamente formate.
Tuttavia, un'altra classe di enzimi, chiamati topoisomerasi di tipo IA, opera in modo diverso. Questi enzimi possono tagliare solo un singolo filamento della scala di DNA. Poiché non possono tagliare entrambi i lati della doppia elica contemporaneamente, si pensava che fossero incapaci di districare due molecole di DNA completamente intatte. Sembravano limitati al lavoro su singoli filamenti o lacune specifiche nel DNA. Ciò creava un enigma: se le cellule si affidano a questi tagliatori a singolo filamento per determinati compiti, come fanno a districare i nodi complessi formati tra due filamenti di DNA completi? La domanda era se esistesse un modo in cui lo stato fisico del DNA stesso potesse cambiare le regole, permettendo a questi tagliatori a singolo filamento di svolgere il lavoro solitamente riservato ai tagliatori a doppio filamento.
I ricercatori del MRC Laboratory of Medical Sciences di Londra si sono posti l'obiettivo di rispondere a questa domanda osservando il processo mentre accadeva in tempo reale. Hanno utilizzato un allestimento sofisticato che coinvolgeva pinzette ottiche, che sono essenzialmente fasci di luce in grado di afferrare e tirare piccoli oggetti. In questo caso, gli oggetti erano microsfere attaccate a lunghi filamenti di DNA. Manipolando queste sfere, gli scienziati potevano attorcigliare il DNA, tenderlo e creare nodi specifici, noti come trecce, dove due molecole di DNA si incrociavano l'una sull'altra. Hanno poi introdotto il complesso enzimatico umano noto come TOP3α, insieme alle sue proteine di supporto RMI1 e RMI2, per vedere se fosse in grado di districare questi nodi.
Il team ha scoperto che la chiave per sbloccare questo processo non era un cambiamento nell'enzima, ma un cambiamento nella tensione e nella torsione del DNA stesso. Quando i filamenti di DNA erano rilassati e tenuti in uno stato standard, non attorcigliato, il complesso enzimatico non riusciva a districare i nodi. I filamenti di DNA rimanevano bloccati insieme e l'enzima semplicemente non riusciva a trovare un modo per entrare. Tuttavia, quando i ricercatori hanno introdotto la superavvolgimento negativo — un tipo specifico di torsione che immagazzina energia nel DNA — la situazione è cambiata drasticamente. Il superavvolgimento negativo è uno stato in cui il DNA è sottotorsionato, creando uno stress torsionale che tende a srotolarsi.
Sotto questo stress, è accaduto qualcosa di straordinario proprio nel punto in cui i due filamenti di DNA si incrociavano. La forza di torsione ha causato la fusione locale o l'apertura della doppia elica proprio nel punto di incrocio. Questa fusione ha creato una piccola bolla temporanea di DNA a singolo filamento. Sebbene il resto della molecola rimanesse una robusta doppia elica, questa piccola apertura era sufficiente affinché l'enzima TOP3α potesse agganciarsi. Una volta che l'enzima si è ancorato a questa bolla a singolo filamento, ha potuto svolgere la sua funzione standard: tagliare il singolo filamento, far passare l'altra molecola di DNA attraverso la fessura e richiuderlo. Questa azione ha sbloccamente con successo i due filamenti di DNA.
I ricercatori hanno scoperto che questo processo era altamente efficiente. Quando il DNA era negativamente superavvolto, il complesso enzimatico districava i nodi in pochi secondi, anche quando il DNA veniva tirato con una forza significativa. Al contrario, quando il DNA era rilassato, l'enzima falliva nel districare i nodi e spesso causava la rottura dei filamenti di DNA. Lo studio ha anche dimostrato che una proteina chiamata RPA, che lega naturalmente il DNA a singolo filamento, aiutava il processo stabilizzando queste piccole bolle fuse, rendendo più facile il lavoro dell'enzima. Un'altra proteina di supporto, RMI2, migliorava l'efficienza della reazione, sebbene il nucleo del complesso enzimatico potesse ancora funzionare senza di essa.
Per confermare che l'enzima stesse effettivamente utilizzando l'apertura a singolo filamento per districare il DNA, il team ha creato un test speciale. Hanno utilizzato un filamento di DNA che aveva già una lacuna preesistente, una sezione mancante di un lato della scala, e l'hanno attorcigliato attorno a un altro filamento di DNA normale e completamente intatto. Anche senza la forza di torsione per creare una nuova bolla, l'enzima ha districato con successo i due filamenti. Ciò ha dimostrato che l'enzima non ha bisogno di tagliare entrambi i filamenti del DNA; ha solo bisogno di accedere a un singolo filamento, il che può essere fornito o da una lacuna preesistente o dalla fusione locale causata dallo stress di torsione.
Questi risultati suggeriscono che l'ambiente fisico del DNA determina quale enzima debba svolgere il lavoro. In uno stato rilassato, il DNA è troppo stretto perché il tagliatore a singolo filamento possa entrare, quindi la cellula deve affidarsi al tagliatore a doppio filamento. Ma quando il DNA è sotto stress torsionale, come durante la replicazione o quando i cromosomi vengono separati, lo stress può forzare il DNA ad aprirsi quanto basta perché il tagliatore a singolo filamento possa intervenire. Questo fornisce un meccanismo fisico che collega lo stato meccanico del DNA alla via enzimatica utilizzata per risolverlo. Lo studio rivela che la cellula non ha bisogno di affidarsi a un unico strumento per ogni compito; invece, la tensione e la torsione del DNA stesso possono trasformare un nodo bloccato in un puzzle risolvibile, permettendo a diversi enzimi di lavorare insieme per garantire la fedele trasmissione delle informazioni genetiche.
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