Reversible fixation of microbial cells for targeted genomics
Questo articolo introduce il ditiobis(succinimidil propionato) (DSP) come un fissativo reversibile che supera i limiti dei metodi tradizionali consentendo sia un'imaging a fluorescenza di alta qualità sia la successiva estrazione del DNA per la genomica mirata da comunità microbiche complesse.
Articolo originale sotto licenza CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Questa è una spiegazione generata dall'IA di un preprint non sottoposto a revisione paritaria. Non è un consiglio medico. Non prendere decisioni sulla salute basandoti su questo contenuto. Leggi il disclaimer completo
Per comprendere le vite nascoste del mondo microscopico, gli scienziati devono spesso scattare un'istantanea di un batterio specifico all'interno di una comunità affollata. Immaginate una vasta e frenetica città dove ogni residente appare quasi identico da lontano. Per studiare una particolare famiglia, un ricercatore deve prima trovarla, poi isolarla senza danneggiare il suo possesso più prezioso: il suo progetto genetico. Per decenni, gli scienziati hanno utilizzato una tecnica chiamata ibridazione in situ fluorescente, o FISH, per agire come un riflettore luminoso. Essi attaccano un piccolo tag luminoso a un pezzetto specifico di materiale genetico all'interno di una cellula, facendo sì che quella cellula si illumini sotto un microscopio. Una volta identificata, queste cellule luminose possono essere separate dal mix utilizzando una macchina che le separa in base alla loro luce. Tuttavia, un grande ostacolo ha a lungo bloccato questo percorso. Per rendere le cellule visibili e abbastanza stabili da poter essere smistate, i ricercatori dovevano solitamente "fissarle", un processo simile alla conservazione di un esemplare in formaldeide o all'immersione in alcol. Sebbene questo preservasse la forma della cellula, agiva anche come una pesante serratura sul materiale genetico, rendendo quasi impossibile leggerne il DNA in seguito. Il medesimo passaggio che permetteva agli scienziati di trovare la cellula giusta spesso distruggeva la capacità di studiarne il genoma, lasciando i microbi più interessanti intrappolati in uno stato silenzioso e illeggibile.
Un team di ricercatori ha ora sviluppato un nuovo modo per aprire questa porta. Hanno introdotto una sostanza chimica chiamata ditiobis(succinimidil propionato), o DSP, che agisce come un fissativo reversibile. Pensate al DSP come a una colla temporanea che tiene insieme la cellula e permette ai tag luminosi di funzionare, ma che può essere sciolta in seguito per rilasciare il DNA intatto. Nel loro studio, gli scienziati hanno testato questo nuovo metodo su batteri provenienti da colture pure, acqua di fiume, sedimenti marini e feci umane. Hanno scoperto che le cellule trattate con DSP brillavano tanto quanto quelle trattate con i tradizionali prodotti chimici aggressivi, e rimanevano stabili per mesi durante lo stoccaggio. Fondamentalmente, quando i ricercatori hanno aggiunto un semplice agente chimico per rompere i legami del DSP, le cellule hanno rilasciato il loro DNA perfettamente, pronto per il sequenziamento. Ciò significa che gli scienziati possono ora identificare un microbo specifico, isolarlo e leggere immediatamente il suo intero codice genetico senza i danni causati dai vecchi metodi di conservazione.
I ricercatori hanno dimostrato la potenza di questo approccio smistando batteri specifici da complessi campioni di feci umane. Si sono concentrati su gruppi di batteri noti per essere importanti per la salute intestinale, come Faecalibacterium e Phocaeicola. Utilizzando il nuovo metodo DSP, sono stati in grado di arricchire questi gruppi specifici fino a settantasette volte rispetto al campione originale. Da queste cellule smistate, sono riusciti a ricostruire genomi di alta qualità, rivelando il pieno potenziale genetico di questi organismi difficili da studiare. In un esempio sorprendente, hanno isolato singole cellule di Phocaeicola vulgatus e, poiché il DNA era stato così ben preservato, sono stati in grado di vedere non solo i geni propri del batterio, ma anche i minuscoli pezzi circolari di DNA chiamati plasmidi e le sequenze virali che vivono al loro interno. Questo livello di dettaglio permette agli scienziati di vedere esattamente quali virus infettano quali batteri e come i batteri condividono i tratti genetici, un livello di risoluzione che era precedentemente fuori portata per questi specifici target.
Lo studio ha anche dimostrato che questo metodo funziona in una vasta gamma di ambienti. Che si tratti di osservare batteri in un fiume, nel fango di mare profondo o nell'intestino umano, il fissativo DSP ha performato in modo coerente. Ha preservato la massa fisica delle cellule, assicurando che non si rimpicciolissero o scomparissero durante lo stoccaggio, e ha funzionato sia per i batteri Gram-negativi che per quelli Gram-positivi, i due principali tipi strutturali di pareti cellulari batteriche. I ricercatori hanno notato che, mentre alcuni metodi più vecchi faticavano con certe pareti cellulari resistenti, il nuovo approccio permetteva l'identificazione e lo smistamento riuscito di una vasta gamma di vita microbica. Combinando la capacità di vedere cellule specifiche con la capacità di leggere il loro DNA, questa nuova tecnica offre uno strumento potente per esplorare il microbioma. Suggerisce che gli scienziati possano ora andare oltre il semplice indovinare quali microbi stiano facendo cosa in una comunità e invece individuare esattamente quali siano attivi, isolarli e leggere le loro storie direttamente dal loro codice genetico.
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