Tunable Phase and Fields iSCAT for High-Sensitivity detection of Single Proteins

Sintesi Tecnica: TPF-iSCAT con Fase e Campi Sintonizzabili per la Rilevazione ad Alta Sensibilità di Singole Proteine

Problematica
Sebbene la microscopia a fluorescenza, in particolare le tecniche di super-risoluzione, abbia rivoluzionato l'imaging biologico, essa si basa su etichette esogene che possono perturbare le funzioni biologiche native ed è limitata dal fotodecoloramento (photobleaching) e dai tassi finiti di emissione di fotoni. La microscopia ottica senza etichette (label-free) offre un approccio complementare indagando le proprietà ottiche intrinseche, tuttavia la microscopia a interferenza di scattering (iSCAT) convenzionale affronta vincoli di prestazione fondamentali. Nello specifico, la iSCAT standard è limitata dalla riflettività fissa dell'interfaccia substrato-acqua e dalla differenza di fase intrinseca tra i campi diffusi e riflessi. Questi fattori creano un equilibrio fisso tra il campo di riferimento e il campo diffuso, impedendo spesso l'ottimizzazione del contrasto interferometrico per target di piccole dimensioni. I tentativi precedenti per affrontare ciò hanno coinvolto ostruzioni fisse o algoritmi di post-elaborazione (ad esempio, il machine learning) per estrarre segnali dal rumore, ma questi non ottimizzano fisicamente il segnale a livello di hardware.

Metodologia: TPF-iSCAT (Fase e Campi Sintonizzabili)
Gli autori introducono la TPF-iSCAT, una piattaforma interferometrica robusta progettata per fornire un controllo indipendente e preciso sia sul rapporto di ampiezza che sulla fase relativa dei campi di luce interferenti. Il sistema utilizza la distinta distribuzione spaziale della luce diffusa e di quella riflessa: la luce diffusa emerge dalla periferia dell'obiettivo, mentre il fascio di riferimento riflesso rimane centrato.

Componenti chiave dell'hardware:

• Lamine a Mezza Onda Anulari (A-HWP): Ruotano selettivamente la polarizzazione della luce diffusa periferica di 90°, lasciando invariato il fascio di riferimento centrale.
• Polarizzatore a Valle: Lavora in combinazione con l'A-HWP per sintonizzare l'ampiezza effettiva del campo riflesso, permettendo di accoppiarlo al campo di scattering.
• Ritardatore a Cristallo Liquido (LC): Introduce uno sfasamento sintonizzabile ($\phi_{tune}$) per regolare la fase relativa tra i campi fino al punto di massima visibilità interferometrica.

Il sistema impiega la rilevazione in quadratura, catturando due immagini con una differenza di fase di 90°. Ciò consente l'estrazione del contrasto di scattering privo di background ($C_{max}$) e della fase di scattering intrinseca, eliminando efficacemente l'ambiguità di fase e convertendo la iSCAT da una tecnica di contrasto sensibile alla fase a una misurazione robusta del campo complesso. Il sistema è ulteriormente stabilizzato rimuovendo i sistemi piezoelettrici a ciclo chiuso per ridurre il drift, utilizzando stadi manuali e attuatori stick-slip a ciclo aperto, e racchiudendo l'intero setup in una scatola isolata acusticamente.

Contributi Chiave

1. Ottimizzazione a Livello Hardware: A differenza dei metodi precedenti che si affidano a filtri fissi o ricostruzioni computazionali, la TPF-iSCAT ottimizza fisicamente il contrasto interferometrico sintonizzando indipendentmente il rapporto di ampiezza (tramite l'angolo del polarizzatore $\theta$) e la fase relativa (tramite il ritardatore LC).
2. Implementazione della Rilevazione in Quadratura: L'integrazione dell'imaging in quadratura consente l'estrazione simultanea dell'ampiezza e della fase di scattering, sopprimendo le fluttuazioni del background e superando i problemi legati allo sfasamento di Gouy durante il movimento assiale.
3. Rilevazione Diretta Senza Etichette: La piattaforma dimostra la capacità di rilevare singole molecole proteiche senza la necessità di etichette esogene o complessi algoritmi di post-elaborazione.

Risultati

• Sintonizzabilità del Contrasto: La validazione sperimentale utilizzando nanoparticelle d'oro da 10 nm ha confermato il modello teorico. È stato dimostrato che il contrasto dipende fortemente dall'angolo del polarizzatore e dallo sfasamento del LC, con il sistema che raggiunge la massima visibilità quando il campo di riferimento viene soppresso rispetto al campo di scattering.
• Caratterizzazione delle Nanoparticelle d'Oro: Le misurazioni di nanoparticelle d'oro con dimensioni compresi tra 2 nm e 15 nm hanno mostrato che l'ampiezza di scattering estratta aumentava monotonicamente con la dimensione della particella, mentre la fase estratta rimaneva costante (43–47°), indicando che la fase è determinata dalle proprietà del materiale e dalla configurazione piuttosto che dal volume.
• Rilevazione di Singole Proteine: Il sistema ha rilevato con successo cinque diverse proteine con masse molecolari comprese tra 5,7 kDa e 70 kDa (Insulina bovina, Mioglobina di cuore di cavallo, GFP, BSA e Malato deidrogenasi).
  • Linearità: È stata osservata una chiara relazione lineare tra l'ampiezza interferometrica estratta e la massa molecolare (R² = 0,95).
  • Limite di Sensibilità: Il sistema ha raggiunto la rilevazione deterministica diretta dell'Insulina bovina (5,7 kDa), spingendo il limite di rilevazione al di sotto della soglia di 9 kDa precedentemente riportata tramite metodi computazionali.
  • Stabilità della Fase: La fase estratta per le specie proteiche è rimasta notevolmente stabile (~135°), supportando i processi di stima della massa.

Significato e Rivendicazioni
L'articolo sostiene che la TPF-iSCAT rappresenti un progresso significativo nella rilevazione ottica senza etichette, spingendo il limite fisico di rilevazione alle singole proteine con masse così basse come 5,7 kDa. Gli autori sottolineano che questo traguardo è distinto dagli approcci computazionali; massimizzando il contrasto interferometrico a livello hardware prima dell'acquisizione dei dati, il sistema fornisce un segnale fisico primario con rapporti segnale-rumore intrinsecamente elevati. Ciò offre una via ad alta fedeltà per la quantificazione deterministica del proteoma a bassa massa, sia come sistema standalone che come fonte di dati ottimizzati per la futura integrazione con il machine learning. Gli autori osservano che, sebbene l'attuale velocità di commutazione del ritardatore LC limiti la risoluzione temporale, il sistema dimostra con successo la fattibilità della rilevazione di biomolecole al di sotto del limite dei 10 kDa senza feedback attivo o complessa ricostruzione algoritmica.