Whole genome sequencing identified a novel copy number variant on TPK1 gene in a Chinese family with thiamine metabolism dysfunction syndrome 5

Sintesi Tecnica: Il sequenziamento dell'intero genoma identifica una nuova CNV in TPK1 per la sindrome da disfunzione del metabolismo della tiamina 5

Problematica
La sindrome da disfunzione del metabolismo della tiamina 5 (THMD5) è una rara malattia neurometabolica autosomica recessiva causata da varianti patogene bialleliche nel gene TPK1, che codifica per la tiamina pirofosfofosfochinasi (TPK). Sebbene siano state documentate oltre 30 varianti patogene, la maggior parte di esse consiste in mutazioni missense. Le variazioni del numero di copie (CNV) che coinvolgono TPK1 sono estremamente rare e spesso non rilevate dal sequenziamento dell'intero esoma (WES) standard o da pannelli genici mirati, che possono non coprire completamente gli esoni codificanti o non rilevare in modo affidabile grandi variazioni strutturali, in particolare quelle con punti di rottura nelle regioni non codificanti. Di conseguenza, la diagnosi di THMD5 in pazienti adulti o in presenza di presentazioni atipiche rimane problematica. Questo studio affronta la necessità di espandere lo spettro genetico di TPK1 e di valutare l'utilità diagnostica del sequenziamento dell'intero genoma (WGS) nell'identificazione di lesioni genetiche complesse.

Metodologia
Lo studio ha analizzato una famiglia cinese con due fratelli affetti (un probando di 31 anni e il fratello maggiore di 33 anni) e tre membri della famiglia non affetti (genitori e un fratello minore).

• Raccolta dei dati clinici: Sono state raccolte anamnesi cliniche complete, esami neurologici, neuroimaging (RM), risultati di laboratorio (inclusa la lattatemia) e valutazioni cognitive (MMSE, MoCA, ADAS-Cog).
• Analisi genetica: Il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) è stato eseguito su tutti i membri della famiglia utilizzando la preparazione di librerie DNA PCR-free di Illumina, raggiungendo una profondità media di 30×. I dati sono stati allineati al genoma umano di riferimento (hg19) tramite BWA e analizzati con il Gene Analysis ToolKit (GATK).
• Validazione e interpretazione delle varianti: Le varianti identificate sono state validate tramite sequenziamento Sanger. Le varianti sono state interpretate utilizzando il Variant Effect Predictor (VEP) e sottoposte a screening contro database (ClinVar, OMIM, HGMD, gnomAD). La patogenicità è stata valutata mediante algoritmi computazionali (SIFT, PolyPhen-2, FATHMM) e classificata secondo le linee guida ACMG/ClinGen. Le CNV sono state interpretate specificamente in base agli standard tecnici per le varianti del numero di copie costituzionali.
• Fase (Phasing): Lo studio ha utilizzato l'analisi della sequenza di lettura divisa (split-read) dei dati WGS per determinare il phasing cis/trans delle varianti eterozigoti composte.

Risultati Chiave

• Fenotipi Clinici:
  • Probando: Esordio all'età di 13 anni con encefalopatia episodica ricorrente, atassia e disartria. Evoluzione in andatura spastica e rigidità degli arti all'età di 19 anni. La RM ha mostrato una lieve atrofia cerebrale, cerebellare e del tronco encefalico. Il lattato sierico era normale. La funzione cognitiva è rimasta ampiamente preservata.
  • Fratello Maggiore: Esordio all'età di 4 anni con sintomi gravi, tra cui lesioni simmetriche dei gangli della base (iperintensità in T2, ipointensità in T1) e lattato sierico elevato (3,65 mmol/L). Evoluzione in spasticità grave, disturbi della deambulazione e compromissione cognitiva (MMSE 20/30), che lo hanno reso incapace di camminare autonomamente entro i trent'anni.
• Risultati Genetici: Il WGS ha identificato varianti eterozigoti composte in TPK1 in entrambi i fratelli affetti:
  1. Una variante missense nota patogena: NM_022445.4:c.382C>T (p.Leu128Phe).
  2. Una nuova CNV: NC_000007.13:g.144285435_144289647dup, una duplicazione tandem di 4,2 kb che coinvolge l'esone 7 e gli introni adiacenti.
  • Il sequenziamento Sanger ha confermato che la variante missense era ereditata dalla madre.
  • L'analisi split-read ha confermato che la CNV era ereditata dal padre ed era in trans con la variante missense.
  • La CNV è stata prevista come causa di interruzione del quadro di lettura e di decadimento mediato dal nonsense (NMD).
• Esiti del Trattamento:
  • Il probando ha ricevuto regolarmente dosi elevate di tiamina (100 mg/die), con conseguente stabilizzazione dei sintomi e assenza di ulteriore deterioramento.
  • Il fratello maggiore ha ricevuto solo un breve ciclo di bassa dose di tiamina (30 mg/die) prima di interrompere il trattamento, portando a un declino neurologico progressivo.

Contributi Principali

1. Espansione dello Spettro Genetico: Lo studio riporta una nuova duplicazione tandem di 4,2 kb in TPK1, espandendo il panorama mutazionale di THMD5 oltre le predominanti varianti missense.
2. Superiorità Diagnostica del WGS: La ricerca dimostra che il WGS è superiore al WES o ai pannelli mirati per l'identificazione di varianti strutturali complesse come le CNV intrageniche e per determinare il phasing delle varianti eterozigoti composte, elemento critico per una diagnosi accurata.
3. Correlazione Genotipo-Fenotipo: Lo studio evidenzia una significativa eterogeneità fenotipica tra i fratelli con genotipi identici. La divergenza nelle traiettorie cliniche è attribuita all'aderenza al trattamento piuttosto che a differenze genetiche.

Significato e Rivendicazioni
Gli autori affermano che i loro risultati sottolineano l'importanza critica della terapia con tiamina ad alto dosaggio per tutta la vita nella gestione della THMD5. Gli esiti contrastanti dei due fratelli — la stabilizzazione nel probando aderente rispetto al declino progressivo del fratello non aderente — forniscono una prova convincente che la terapia con tiamina può arrestare la neurodegenerazione anche se iniziata in una fase avanzata della malattia.

Inoltre, l'articolo sostiene che il WGS dovrebbe essere integrato nel percorso diagnostico delle malattie metaboliche ereditarie, in particolare quando i test genetici iniziali non riescono a fornire una diagnosi molecolare. Identificando una nuova CNV che probabilmente sarebbe sfuggita ad altri metodi, lo studio rinforza la necessità di un'analisi genomica completa per scoprire la piena eziologia genetica delle malattie metaboliche rare. Gli autori raccomandano l'inizio immediato della terapia con tiamina ad alto dosaggio al minimo sospetto clinico o genetico di THMD5 per prevenire danni neurologici irreversibili.