CRISPR/Cas12a-based Simplified Lateral Flow Assay for Sensitive Detection of OTA and AFB1

Negli angoli silenziosi dell'agricoltura globale, minacce invisibili si annidano spesso nei cereali che mangiamo. Grano, mais e riso possono essere contaminati da funghi che producono sostanze tossiche note come micotossine. Due delle più pericolose di queste sono l'Ocratossina A e l'Aflatossina B1. Questi veleni non si limitano a guastare il cibo; possono causare gravi danni al fegato e ai reni, indebolire il sistema immunitario e persino colpire il sistema nervoso quando entrano nel corpo umano attraverso la dieta o l'inalazione. Poiché queste tossine sono così dannose, i governi di tutto il mondo hanno stabilito limiti rigorosi su quanto possano essere presenti nei prodotti alimentari. Tuttavia, trovarle è difficile. I metodi tradizionali richiedono l'invio di campioni in laboratori costosi, pieni di macchine grandi e complesse che necessitano di operatori esperti per essere utilizzate. Questi processi sono lenti e costosi, rendendo difficile controllare la sicurezza alimentare rapidamente nei campi o nei mercati locali dove le risorse sono limitate.

Per risolvere questo problema, i ricercatori della Nantong University in Cina hanno sviluppato un nuovo modo per rilevare queste tossine che è veloce, sensibile e abbastanza semplice da poter essere utilizzato senza un laboratorio. Il loro lavoro si concentra su uno strumento preso in prestito dai sistemi di difesa della natura stessa: una proteina chiamata Cas12a, che agisce come una forbice molecolare. Nel suo stato naturale, questa proteina aiuta i batteri a combattere i virus tagliando il materiale genetico estraneo. Gli scienziati hanno imparato a programmare questa proteina affinché riconosca sequenze specifiche di DNA. Quando trova il suo bersaglio, non si limita a tagliare una volta; entra in un frenetico stato di attività, tritando qualsiasi filamento di DNA nelle vicinanze che riesca a trovare. Questo comportamento, noto come trans-clivaggio, può essere sfruttato per creare un segnale. Se il bersaglio è presente, la proteina si attiva e taglia una molecola reporter, creando un cambiamento visibile. Combinando questo meccanismo biologico con una semplice striscia di test che somiglia a un test di gravidanza, il team ha creato un dispositivo in grado di individuare minuscole quantità di veleno nel cibo con una velocità e un'accuratezza straordinarie.

I ricercatori si sono concentrati sulla creazione di un sistema in grado di rilevare sia l'Ocratossina A che l'Aflatossina B1 contemporaneamente. Hanno progettato un interruttore molecolare speciale composto da filamenti di DNA. Una parte di questo interruttore è un aptamero, un pezzo di DNA dalla forma studiata per aggrapparsi a una specifica tossina come una chiave che si inserisce in una serratura. Quando la tossina è presente in un campione, si lega a questo aptamero. Questo evento di legame costringe l'interruttore di DNA a cambiare forma, rilasciando un secondo filamento di DNA precedentemente nascosto. Questo filamento rilasciato agisce quindi come una chiave per attivare la proteina Cas12a. Una volta attivata, la proteina inizia a tritare una molecola reporter che è stata etichettata con speciali marcatori. Questi marcatori sono progettati per aderire a linee specifiche su una striscia di test.

La striscia di test stessa è un piccolo dispositivo portatile contenente una membrana di nitrocellulosa con diverse linee disegnate su di essa. I ricercatori hanno posizionato diversi anticorpi su queste linee per catturare i pezzi del reporter tagliati. Una linea cattura i pezzi che indicano la presenza di Ocratossina A, mentre un'altra cattura quelli per l'Aflatossina B1. Una terza linea serve come controllo per garantire che il test funzioni correttamente. Per rendere i risultati visibili, il team ha utilizzato minuscole particelle chiamate quantum dot, che brillano intensamente sotto una luce specifica. Quando la striscia di test viene immersa nella miscela, se le tossine sono presenti, le particelle luminose si accumulano sulle linee di test, creando un segnale visibile che può essere visto a occhio nudo o catturato con la fotocamera di uno smartphone.

Uno dei miglioramenti più significativi di questo nuovo metodo riguarda il modo in cui gestisce la preparazione del campione. I metodi più vecchi richiedevano spesso una fase in cui venivano utilizzate microsfere magnetiche per separare il bersaglio dal resto del liquido, un processo che necessitava di attrezzature extra e tempo. Il nuovo sistema sostituisce questo passaggio con una semplice linea sulla striscia di test rivestita con una proteina chiamata streptavidina. Questa linea cattura le molecole di reporter non tagliate, pulendo efficacemente il campione mentre scorre attraverso la striscia. Ciò elimina interamente la necessità di separazione magnetica, rendendo il processo molto più veloce e facile da eseguire sul campo. Inoltre, il sistema è progettato in modo che la stessa proteina Cas12a e le stesse istruzioni genetiche possano essere utilizzate per rilevare diverse tossine. Per passare dal rilevamento di un veleno all'altro, i ricercatori devono solo cambiare l'aptamero di DNA che aggancia la tossina. Questa flessibilità significa che il costo per testare diversi contaminanti è mantenuto molto basso.

Quando il team ha testato il proprio dispositivo, i risultati sono stati impressionanti. Hanno scoperto che il sistema poteva rilevare l'Ocratossina A a livelli anche di 50 picogrammi per millilitro e l'Aflatossina B1 a 250 picogrammi per millilitro. Per dare un termine di paragone, questi limiti sono significativamente inferiori a ciò che le normali strisce di test commerciali possono rilevare, rappresentando un miglioramento della sensibilità da dieci a cento volte. I ricercatori hanno testato il dispositivo con campioni reali, tra cui farina di mais e di grano che erano state caricate con quantità note di tossine. Il dispositivo ha identificato correttamente la presenza delle tossine in quasi tutti i casi, mostrando un alto tasso di accuratezza. In un test in doppio cieco, dove una persona preparava i campioni e un'altra testava senza sapere quali fossero positivi, il sistema ha identificato correttamente quasi tutti i campioni positivi e la maggior parte di quelli negativi.

I ricercatori hanno anche esplorato un modo intelligente per utilizzare il test per ottenere una rapida risposta "sì o no". Mescolando i componenti di rilevamento per entrambe le tossine in un unico tubo, hanno creato una porta logica che funziona come un interruttore "OR". Se l'Ocratossina A o l'Aflatossina B1 è presente, il sistema si attiva e produce un segnale positivo su una singola linea di test. Ciò significa che un utente non deve eseguire due test separati per sapere se il proprio grano è contaminato; un singolo risultato dice se uno dei due pericoli è presente. Questo approccio semplifica ulteriormente il flusso di lavoro, rendendolo ideale per lo screening rapido in ambienti frenetici.

Lo studio conferma che questo nuovo metodo non è solo sensibile, ma anche pratico per l'uso in luoghi privi di strutture di laboratorio avanzate. L'intero processo, dalla miscelazione del campione alla lettura del risultato, richiede meno di un'ora e non necessita di macchinari complessi. Il segnale visivo è abbastanza forte da essere visto senza lettori costosi, sebbene una fotocamera di uno smartphone possa essere utilizzata per misurare l'intensità per ottenere un numero più preciso. Il team ha dimostrato che il metodo funziona bene anche con campioni alimentari complessi come la farina, che spesso contiene molte altre sostanze che possono interferire con i test. Rilevando con successo le tossine in queste condizioni reali, i ricercatori hanno dimostrato che il loro dispositivo è robusto e affidabile.

Questo lavoro rappresenta un passo avanti significativo nel monitoraggio della sicurezza alimentare. Prende uno strumento biologico sofisticato e lo semplifica in un formato accessibile a chiunque. La capacità di rilevare tossine pericolose a livelli così bassi, senza la necessità di attrezzature costose o personale altamente qualificato, offre un nuovo modo potente per proteggere la salute pubblica. Che si tratti di un villaggio remoto o di un mercato del grano affollato, questa tecnologia fornisce un modo per garantire che il cibo che la gente mangia sia sicuro. I ricercatori suggeriscono che questa strategia potrebbe essere estesa per rilevare altre sostanze nocive in futuro, trasformando potenzialmente il modo in cui monitoriamo la sicurezza della nostra catena alimentare su scala globale. Rendendo il test ad alta sensibilità semplice ed economico, questo approccio aiuta a colmare il divario tra la scienza avanzata e la sicurezza quotidiana.