High Resolution Multi-Pass Astral Analyzer Quantification Enables Highly Multiplexed 35-Plex Tandem Mass Tag Proteomics

本研究では、スロースキャンモードでイオン経路を 90m に延長し m/z 128 付近の分解能を大幅に向上させた Orbitrap Astral の新機能「TMT HR モード」を開発し、これにより 35 重の TMT 定量分析を従来の Orbitrap 法よりも深いカバレッジで実現し、MS3 法と同等の精度を達成できることを示しました。

要約

1. 背景：「35 人分の声」を聞き分ける難しさ

まず、この研究の舞台は**「タンパク質の分析」**です。
細胞の中には何万種類ものタンパク質が混ざっています。研究者は、例えば「健康な細胞」と「病気の細胞」を比較して、どのタンパク質が増えたり減ったりしているかを知りたいのです。

• 従来の方法（TMT 法）：
  複数のサンプルに、それぞれ異なる色の「タグ（目印）」をつけます。これを混ぜて一度に分析します。
  • 18 人までなら OK： 以前は、18 種類のサンプルを同時に分析できる技術がありましたが、それ以上は難しくなっていました。
  • 35 人への挑戦： 今回、研究者は「35 人（35 プレックス）」を同時に分析できる新しいタグを開発しました。しかし、これには大きな壁がありました。

【壁の正体：音の混濁】
35 種類のタグは、非常に似ている周波数（質量）を持っています。
これを例えるなら、**「35 人の合唱団が、ほぼ同じ高さの『アー』という音を出している状態」です。
普通のマイク（従来の装置）では、音が混ざってしまい、「誰がどれくらい歌っているか」を正確に聞き分けることができません。これを聞き分けるには、「超高性能なマイク（超高解像度の装置）」**が必要だったのです。

2. 解決策：「3 周走る」ことで音をクリアにする

そこで登場するのが、**「Astral（アストラル）アナライザー」**という新しい装置です。
この装置は、イオン（带电した粒子）を「鏡の迷路」のような通路に送り込み、反射させながら進ませる仕組みを持っています。

• 通常モード： イオンは 1 回だけ迷路を走り抜けます。
• 新しい「TMT HR モード」： ここが今回のキモです。イオンを迷路の中で**「3 周（3 回）」**走らせました。

【アナロジー：ランナーの距離】

• 1 周だけ走るランナー： 距離が短いため、少しのズレでも気づきません。
• 3 周走るランナー： 距離が 3 倍になります。すると、「わずかな足の長さの違い（質量の違い）」が、ゴール地点で大きな差として現れます。

この「3 周走らせる（マルチパス）」技術を使うことで、装置の性能が劇的に向上し、35 人の合唱団（35 プレックスのタグ）の声を、一人一人はっきりと聞き分けられるようになりました。

3. 工夫：「2 つのカメラ」で撮影する

しかし、3 周走らせるには時間がかかります。もし毎回 3 周走らせると、分析に時間がかかりすぎて、多くのタンパク質を見逃してしまいます。

そこで、研究者は**「2 つのカメラで撮影する」**という聪明的な方法を考えました。

1. カメラ A（正体確認）： 短時間で素早く撮影し、「これは誰（どのタンパク質）か？」を特定する。
2. カメラ B（人数数え）： 特定したタンパク質だけを狙って、ゆっくりと「3 周走らせるモード」で撮影し、「何人いるか（量）」を正確に数える。

【アナロジー：犯人探し】

• カメラ A： 通りを素早くスキャンして、「あそこに犯人がいた！」と特定する（スピード重視）。
• カメラ B： 犯人の顔をズームインして、ゆっくりと詳しく観察し、証拠を固める（精度重視）。

このように、「スピード」と「精度」を別々の工程で両立させたのが、この研究の最大の功績です。

4. 結果：何が実現できたのか？

この新しい方法を実験したところ、驚くべき成果が出ました。

• 35 人同時分析の成功： 以前は不可能だった「35 種類のサンプル」を一度に分析し、それぞれの量を正確に計測できました。
• 深掘り分析： 従来の方法では見逃していた、少ない量のタンパク質（「小さな声」）まで見つけることができました。
• ゴールドスタンダードに匹敵： これまで「最高峰（ゴールドスタンダード）」とされていた別の分析方法よりも、多くのタンパク質を特定しながら、同じくらい正確な数値を出せました。

まとめ

この論文は、**「35 人もの合唱団の声を、一度に、かつ一人一人の声を聞き分けながら、正確に数える」という不可能に近い課題を、「イオンを迷路で 3 周走らせる」というアイデアと、「2 つの撮影モードを組み合わせる」**という工夫で解決したことを報告しています。

これにより、がん研究や創薬など、複雑な生体メカニズムを解明する研究が、これまで以上に高速かつ詳細に行えるようになり、医学の進歩に大きく貢献することが期待されています。

技術概要

以下は、提示された論文「High Resolution Multi-Pass Astral Analyzer Quantification Enables Highly Multiplexed 35-Plex Tandem Mass Tag Proteomics」の技術的な詳細な要約です。

1. 背景と課題 (Problem)

• TMT 技術の進化と限界: タンデムマスタグ（TMT）は、高スループットかつ高精度なタンパク質定量分析を可能にする重要な技術です。最近、重水素化されたレポーターチャネルの追加により、TMTpro のマルチプレックス化が 18 プレックスから 35 プレックスへ拡大されました。
• 分解能の要求: 35 プレックス TMT では、重水素化によりレポーターイオンが 3 mDa 間隔で 4 つのグループ（クワドプレット）を形成します。これらを正確に分離・定量するには、m/z 128 において約 10 万（100k）の分解能が必要です。
• 既存機器の制約:
  • 従来の単一反射型飛行時間（TOF）分析器は、この分解能要件を満たせません。
  • 多反射型分析器である「Astral（ASymmetric TRAck Lossless）」分析器は通常 7 万程度の分解能を持ちますが、空間電荷効果（イオン数増加による分解能低下）や、標準的な単一パスモードでは 35 プレックスの 3 mDa 間隔を分離するのに十分な分解能が得られないという課題がありました。
  • また、多パスモード（イオンを往復させるモード）は分解能を向上させますが、通常は質量範囲が狭まり、ペプチド断片の同定とレポーターイオンの定量を同時に行うことが困難でした。

2. 提案された方法論 (Methodology)

本研究では、Thermo Scientific™ Orbitrap™ Astral™ Zoom 質量分析計向けに、新しいデータ依存型分析法を開発しました。

• 多パスモード（TMT HR モード）の活用:
  • Astral 分析器内の「リレープリズム（Relay Prism）」を、イオン注入時は透過モード、内部反射中はトラップモード（電圧切り替え）に制御することで、イオンが分析器内を 3 往復（全長 90m）するように設計しました。
  • これにより、狭い m/z 範囲において分解能を 2 倍以上（10 万以上）に向上させました。
• 2 段階の MS2 スキャン戦略:
  • 従来の単一スキャンでは不可能だったため、ペプチド同定と定量を分離したペア測定を導入しました。
    1. ペプチド同定スキャン: 通常の単一パス Astral MS2 スキャンで、広い質量範囲のペプチド断片を高速に取得し、ペプチドを同定します。
    2. TMT HR 定量スキャン: 直後に、多パスモード（TMT HR モード）で高分解能スキャンを行い、既知の m/z を持つ TMT レポーターイオンのみを高感度・高分解能で定量します。
• 技術的課題の解決:
  • 焦点面のズレ: 単一パスと多パスモードを高速切り替える際、イオンパケットの焦点面が検出器からずれる問題が発生します。これを解決するため、高電圧電源の安定化に時間を要するミラー電極の調整ではなく、イオンの平均速度を微調整する「低電圧補正電極（または接地されていた最初の電極を浮遊させる方式）」を採用し、サブミリ秒単位での高速補正を可能にしました。
  • 空間電荷効果への耐性: 多パスモードではイオン伝送効率が低下（40-65% の損失）するため、検出器へのイオン密度が高まり空間電荷効果が顕著になります。これを補うため、分解能を若干犠牲にして空間電荷耐性を高めるチューニングを行い、低入力モード（Low Input Mode）で検出器ゲインを上げ、S/N 比を向上させました。

3. 主要な貢献 (Key Contributions)

• 35 プレックス TMT 分析の実現: Astral 分析器の多パスモードを TMT 定量に特化して適用し、3 mDa 間隔のレポーターイオンを分離可能な世界初の手法を確立しました。
• Orbitrap-Astral Zoom への統合: Orbitrap による全質量スキャン（MS1）と、Astral によるペプチド同定（MS2）および高分解能定量（TMT HR モード）をシームレスに連携させる新しいワークフローを提案しました。
• 高速かつ高深度な分析: 従来の Orbitrap 単独の MS3 法（ゴールドスタンダード）と比較して、分析深度を維持・向上させつつ、スループットを大幅に向上させる手法を提示しました。

4. 結果 (Results)

• 分解能と定量精度:
  • 35 プレックス相当の 32 プレックス TMTpro 標識 HeLa 細胞溶解液（1:4 の濃度比）において、TMT HR モードは 4,500 以上のタンパク質群を定量しました。これに対し、単一パスモードでは分解能不足により定量可能なタンパク質が 10 個程度に激減しました。
  • 1:4 の濃度比が狭い変動で正確に再現され、隣接ピーク間のクロス talk（干渉）は最小限に抑えられました。
• 酵母標準試料での検証:
  • 11 プレックス TMT 酵母試料では、TMT HR モードを使用しても、通常の Orbitrap-Astral 分析と比較して分析深度（定量されたペプチド数やタンパク質数）の低下は見られませんでした。
• 低入力モードの効果:
  • 検出器ゲインを上げる「Low Input モード」を適用したところ、レポーターチャネルの中央値 S/N 比が 50 未満から 130 以上に向上し、定量可能なタンパク質群が 1,750 から 2,750 へと大幅に増加しました。
• ゴールドスタンダードとの比較（2 細胞株 35 プレックス）:
  • 250 ng の 2 細胞株（HCT116 と HEK293T）混合サンプルを 90 分分析した結果、TMT HR モードは 2,320 個のタンパク質を定量しました。
  • これに対し、Orbitrap Eclipse による RTS-SPS-MS3 法（ゴールドスタンダード）は 1,330 個でした。
  • 主成分分析（PCA）では、TMT HR モードと MS3 法の定量精度は同程度であることが示されました。特に、重水素化による保持時間のズレ（デューテリウム効果）によるばらつきが、TMT HR モードでは MS3 法よりも大幅に小さく抑えられており、Orbitrap Astral Zoom の高速性が寄与していることが示唆されました。

5. 意義と結論 (Significance and Conclusion)

• 高次マルチプレックス化の扉: この手法は、35 プレックスという極めて高いマルチプレックス数を、従来の Orbitrap 単独の MS3 法よりも高いスループットと分析深度で実現可能にしました。
• プロテオミクス研究へのインパクト:
  • 実験スループットが倍増し、複雑な生体サンプルの網羅的解析が可能になります。
  • 低入力サンプル（単一細胞など）を多数プールして分析する際、Astral 分析器の高い感度とこの高分解能定量法の組み合わせにより、微量サンプルからの深層解析が飛躍的に進歩します。
• 技術的展望: 多パスモードは従来、調整の難しさや質量範囲の制限から実用化が難しかったですが、TMT 定量という特定の用途に特化することでその可能性を最大限に引き出すことに成功しました。今後は、MS1 スキャンへの応用や、TMTc 補完イオンの測定など、他の分野への展開も期待されます。

要約すれば、本研究は**「Astral 分析器の多パスモードを TMT 定量用に最適化し、Orbitrap-Astral Zoom 質量分析計上で 35 プレックス TMT による高深度・高スループットプロテオミクス分析を可能にした」**画期的な技術開発です。