A Noncontiguous Code for RNA-Guided DNA Recognition Preceded CRISPR

기술 요약: CRISPR에 선행하는 비연속적 코드의 RNA 유도 DNA 인식

문제 및 동기
CRISPR-Cas와 같은 RNA 유도 시스템은 가이드 RNA와 표적 사이의 연속적인 염기 쌍 형성을 통해 핵산을 프로그래밍 가능하게 인식한다. CRISPR 시스템은 잘 알려져 있지만, 이들의 핵심 이펙터 단백질인 RAMP(Repeat-Associated Mysterious Proteins)의 진화적 기원은 여전히 불분명하다. RAMP는 CRISPR 클래스의 방사(radiation) 이전 단계인 최한계 공통 조상(LUCA)까지 거슬러 올라가는 것으로 추정되지만, 그 계보가 명확히 정의되지 않았다. 또한, 알려진 모든 RNA 유도 시스템은 연속적인 가이드-표적 쌍 형성에 의존한다. 저자들은 선조 RAMP를 식별하여 CRISPR의 진화적 뿌리를 추적하고, 비연속적인 방식의 RNA 유도 인식 메커니즘이 존재하는지 확인하고자 했다.

방법론
본 연구는 서열 상동성 대신 구조 기반의 발견 파이프라인을 채택하였다. 이는 RAMP들이 낮은 서열 유사성을 공유하기 때문이다.

1. 구조 검색: 보존된 RNA 인식 모티프(RRM) 코어, 글리신 풍부 루프(G-loop), 그리고 thumb 도메인을 쿼리로 사용하여, 저자들은 DALI 구조 유사성 검색을 통해 클러스터링된 AlphaFold 데이터베이스를 탐색하였다.
2. 유전체 맥락 분석: 식별된 히트(hits)들은 CRISPR 어레이가 없으면서 최소한의 오페론(일반적으로 하나의 단백질 코딩 유전자와 하나의 부수적 유전자로 구성됨)을 포함하는 유전체 위치를 기준으로 필터링되었다.
3. RNA 시퀀싱 및 특성 분석: SUSP1 파지(VIPR 시스템을 인코딩함)에 감염된 E. coli와 VIPR 시스템을 이종 발현시킨 세포에 대해 소형 RNA 시퀀싱(sRNA-seq)을 수행하였다. Vipr 단백질과 함께 정제된 RNA들을 분석하여 서열 모티프와 이차 구조를 조사하였다.
4. 표적 예측 및 검증: Evo2 유전체 언어 모델과 HMMER를 사용하는 계산 파이프라인을 사용하여, 가이드 RNA 내의 가변적인 디뉴클레오티드 사이의 "스킵(skip)" 패턴(0~3 뉴클레오티드)을 테스트함으로써 표적 규칙을 추론하였다.
5. 기능 분석:
   • In vitro: 형광 표지된 dsDNA 표적과 salmon sperm 경쟁 DNA를 이용한 경쟁 결합 분석.
   • In vivo: 전사 억제를 테스트하기 위한 E. coli 내 GFP 억제 분석; 용균성 파지에 대한 방어 능력을 평가하기 위한 플라크 분석 및 액체 배양 성장 곡선; 그리고 용원성 세포에서 용해를 유발할 수 있는 능력을 테스트하기 위한 프로파지 유도 분석.

주요 기여 및 결과

1. VIPR 시스템의 발견
저자들은 VIPR(Viral Interference Programmable Repeat)이라 명명된 이전에 알려지지 않은 시스템 패밀리를 식별하였다. CRISPR 로커스와 달리, VIPR 로커스는 매우 미니멀하며, 일반적으로 vipr 유전자(RAMP 상동체)와 vap(VIPR 부수 단백질) 유전자만을 인코딩한다. VIPR은 주로 박테리오파지와 아키얼 바이러스(식별된 시스템의 약 71%)에서 발견되며, 이는 세포가 아닌 바이러스 게놈에서 기원했음을 시사한다. 계통 발생 분석 결과, Vipr 단백질은 모든 알려진 CRISPR RAMP(Cas5, Cas6, Cas7)와 구별되는 초기 분지 클레이드로 나타났으며, CRISPR 이펙터에서 발견되는 이차 RRM 도메인 및 기타 정교한 구조가 결여되어 있었다.

2. vrRNA와 비연속적 코드
VIPR 시스템은 vrRNA라고 불리는 가이드 RNA를 사용하며, 이는 9~16개의 YNNGG 모티프(Y는 피리미딘, N은 임의의 염기) 탠덤 반복 구조로 구성된다.

• 구조: 반복 구조는 보존된 3' 테일의 슈도커노트(pseudoknot) 구조에 의해 캡핑된다.
• 서열 논리: 반복 구조의 GGY 부분은 보존되어 있는 반면, NN 디뉴클레오티드는 초가변적이다.
• 인식 메커니즘: 저자들은 vrRNA가 비연속적 코드를 통해 이중 가닥 DNA를 인식한다는 것을 입증하였다. 가변적인 NN 디뉴클레오티드는 표적 DNA와 결합할 때 하나의 "스킵" 뉴클레오티드(1 nt skip rule)를 사이에 두고 결합한다. 보존된 GGY 모티프는 염기 쌍을 형성하지 않으며, 아마도 단백질의 thumb 도메인에 의해 수용되어 해당 위치의 염기 쌍 형성을 방해하는 것으로 보인다. 이 메커니즘을 통해 시스템은 스킵 염기가 코돈의 세 번째(wobble) 위치와 일치하는 표적을 인식할 수 있으며, 이는 동의 치환(synonymous mutations)을 통한 바이러스의 저항성 회피를 방지할 수 있게 한다.

3. 기능적 검증

• 결합 특이성: In vitro 분석을 통해 Vipr-vrRNA 리보핵산단백질(RNP)이 과량의 경쟁 DNA 존재 하에서도 1 nt skip 패턴을 가진 DNA 표적에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
• 프로그래밍 가능성: 시스템은 완전히 프로그래밍 가능하다; vrRNA의 NN 디뉴클레오티드만 변경하면 복합체를 새로운 DNA 표적으로 재지시할 수 있다. Cas9과 달리 VIPR은 PAM(Protospacer Adjacent Motif)을 필요로 하지 않으며, 코딩 가닥 또는 템플릿 가닥 모두를 표적으로 할 수 있다.
• 생물학적 기능: VIPR 시스템은 파지 간의 전쟁을 수행하는 대리인으로 기능한다. SUSP1 파지에서 vrRNA는 SUSP1에 기생하는 위성 파지를 표적으로 한다. Pseudomonas fulva에서 vrRNA는 상주 프로파지를 표적으로 하며, 종종 용원-용균 전환 조절 인자에 집중한다.
• 방어 및 유도:
  • 방어: 랴티릭(lytic) λ 파지의 cro 유전자를 표적으로 하는 VIPR 시스템을 발현시켰을 때 플라크 효율이 5개 차수(orders of magnitude)만큼 감소하였다.
  • 유도: 상주하는 λ 용원성 세포의 cI 억제자를 표적으로 하여 프로파지 유도 및 용해를 유발하였다.
  • 강화: 부수 단백질인 vap1의 공동 발현은 파지 제한 능력을 향상시켰다.

4. 진화적 함의
본 연구는 단백질 계통 발생과 로커스 구조에 따라 7가지의 뚜렷한 VIPR 유형을 식별하였다. 일부 유형(III 및 V)은 원핵생물의 방어 섬(defense islands)에 풍부하며 예측된 뉴클레아제를 인코딩하는데, 이는 파지 간 경쟁에서 숙주 항파지 면역으로의 전환을 시사한다. 저자들은 원핵생물이 선조의 바이러스 인코딩 VIPR 시스템을 이용(co-opted)했을 것이라고 제안한다. 이러한 시스템에 Cas1 유사 트랜스포제(transposase)가 결합되면서 유전 가능한 면역 기억을 제공했을 수 있으며, 이것이 최초의 CRISPR 시스템의 출현으로 이어졌을 것이다.

의의
본 논문은 VIPR 시스템이 CRISPR보다 앞선, 고대의 바이러스 기원 RNA 유도 DNA 인식 메커니즘임을 주장한다. 비연속적 인식 코드의 발견은 RNA 유도 시스템의 가이드-표적 특이성이 반드시 연속적이어야 한다는 패러다임에 도전한다. 저자들은 "적응 면역의 뿌리는 고대 바이러스 간의 전쟁에 있다"고 주장하며, CRISPR-Cas 시스템이 원핵생물에 의해 바이러스의 VIPR 기제(machinery)를 탈취(hijacking)함으로써 진화했다고 상정한다. 이 발견은 유전적 제어를 위한 프로그래밍 가능한 플랫폼으로서, 최소한의 규모(~20 kD 단백질, <100 nt RNA)와 PAM이 없는 설계 공간을 확장하며, 향-유전체 편집 및 이미징 분야에서의 잠재적 응용 가능성을 제시한다.