Domain Insertion Improves the Precision of a CRISPR Adenine Base Editor

당신에게 '베이스 에디터(Base Editor)'라고 불리는 아주 똑똑한 분자 가위-펜 팀이 있다고 상상해 보세요. 이 팀의 임무는 당신의 DNA에서 특정 글자(‘A’)를 찾아 다른 글자(‘G’)로 바꾸어 유전 코드의 오타를 고치는 것입니다. 이 팀의 스타 플레이어는 TadA8e라는 단백질입니다. 이 단백질은 믿을 수 없을 정도로 빠르고 효율적이지만, 한 가지 문제가 있습니다. 바로 너무 의욕이 넘친다는 점입니다.

TadA8e를 긴 팔을 가진 그래피티 아티스트라고 생각해 보세요. 이 아티스트는 페인트를 칠할 지점을 찾으면 바로 작업을 시작합니다. 하지만 팔이 너무 길고 유연하기 때문에, 목표 지점 바로 옆에 있는 글자들에도 실수로 페인트를 뿌리곤 합니다. DNA의 세계에서 이러한 우발적인 변화를 "바이스탠더 편집(bystander edits)"이라고 부릅니다. 이는 단백질이 목표로 하는 글자뿐만 아니라 그 주변의 여러 'A' 글자들까지도 손을 뻗어 건드리기 때문에 발생합니다.

과학자들은 영리한 질문을 던졌습니다. "만약 아티스트의 팔에 크고 묵직한 배낭을 메게 한다면 어떻게 될까?"

그들은 만약 TadA8e 단백질에 커다란, 해롭지 않은 단백질 "도메인"(마치 무거운 배낭 같은 것)을 붙인다면, 이것이 물리적인 스토퍼 역할을 할 것이라고 가설을 세웠습니다. 이 배낭은 아티스트의 팔이 얼마나 멀리 뻗을 수 있는지를 제한하여, 단백질이 딱 바꿔야 할 글자에만 집중하고 주변의 이웃 글자들은 무시하도록 강제할 것이라는 생각입니다.

실험: 다양한 배낭 써보기
이 배 가능하다면, 연구진은 단순히 추측해서 배낭을 붙인 것이 아닙니다. 그들은 컴퓨터 모델과 단백질의 3D 지도를 사용하여, 기계를 고장 내지 않고 새로운 조각을 삽입할 수 있는 안전한 표면 위치를 찾아냈습니다. 그들은 LOV2(청색광에 민감한 단백질)라는 단백질을 여덟 군데의 서로 다른 위치에 삽입하여 실험했습니다.

결과는 다음과 같았습니다:

• 배낭은 효과가 있었다: 대부분의 경우, 단백질은 배낭을 감당해 낼 수 있었습니다. 에디터는 여전히 작동했지만, "페인트 스프레이" 효과는 줄어들었습니다.
• 마법의 지점: 그들은 배낭을 삽입했을 때 판도를 바꿀 수 있는 특정 지점인 L68을 발견했습니다. 이곳에 superfolder GFP(초록색으로 빛나는 단백질)를 넣었을 때, 에디터는 믿기 힘들 정도로 정밀해졌습니다. 이 에디터는 목표 지점(위치 5)에서의 높은 속도를 유지하면서도, 주변 글자들을 편집하는 현상을 거의 완전히 멈추었습니다.
• 배낭의 종류가 아닌, 배낭 그 자체가 핵심이다: 사용된 단백질의 종류 때문이 아니라는 것을 증명하기 위해, 그들은 LOV2와 GFP를 빛을 내지 않는 전혀 다른 단백질인 PDZ로 교체했습니다. 결과는 동일하게 편집 창(editing window)이 좁아졌습니다. 이는 편집의 정밀도가 배낭이 무엇인지보다 배낭의 크기와 위치에 더 달려 있음을 시사합니다.

그들이 배제한 것들
연구진은 자신들의 "배낭" 아이디어가 실제로 의도한 대로 작동하는지 확인하기 위해 매우 신중했습니다.

• 단순히 느려진 것이 아니다: 때때로 기계를 고장 내거나 작동을 느리게 만들면 더 정밀해지기도 합니다. 하지만 저자들은 이것이 단순히 에디터가 게을러진 것이 아님을 보여주었습니다. L68 변이체는 목표 지점에서 여전히 매우 빨랐으며, 단지 어디에서 멈출지에 대해서만 매우 까다로워졌을 뿐입니다.
• 빛과는 상관없다: 연구진은 처음에 LOV2 도메인을 통해 청색광으로 에디터를 제어할 수 있을지(켜고 끄는 기능) 기대했습니다. 그러나 청색광은 편집에 아무런 영향을 주지 못했습니다. 배낭은 이 특정 단백질에 대해 빛 스위치 역할을 하지 못했습니다. 정밀함은 빛에 대한 민감성이 아니라 물리적인 부피에서 온 것이었습니다.
• 단순히 "나쁜" 발현 때문이 아니다: 그들은 배낭 때문에 단백질이 불안정해지거나 생산되기 어려워진 것은 아닌지도 확인했습니다. 데이터에 따르면, 개선된 정밀도는 단백히 단백질이 적게 떠다니기 때문이 아니라 삽입된 물리적 제약 때문이었습니다.

멋진 보너스: 빛나는 추적기
그들이 가장 좋은 버전으로 사용한 빛나는 단백질(sfGFP) 덕분에, 그들은 공짜 보너스 기능까지 얻었습니다. 이제 이 에디터는 세포 안에서 초록색으로 빛납니다. 이는 과학자들이 세포를 깨뜨릴 필요 없이 초록색 빛을 보는 것만으로도 세포 안에 에디터가 있는지 쉽게 확인할 수 있음을 의미합니다.

숫자로 보는 결과
이 새로운 "L68-sfGFP" 에디터를 실제 DNA에 테스트했을 때:

• 목표 지점에서의 높은 편집 효율을 유지했습니다 (실험에 따라 원래 속도의 80% 이상).
• "편집 창"(접촉하는 글자의 범위)을 넓은 범위인 A2 ~ A12에서 좁고 집중된 범위인 A4 ~ A8로 좁혔습니다.
• 스스로 만드는 오류(Cas-독립적 오프 타겟 편집)를 거의 완전히 차단하여, 이 오류율을 편집이 없는 대조군 수준으로 낮추었습니다.

여전히 미스터리로 남은 것들
이 논문은 이 "배낭" 전략이 훌륭하게 작동한다는 것을 보여주지만, 저자들은 왜 L68 지점이 그토록 완벽한지에 대한 정확한 기계적 이유를 아직 모른다고 인정합니다. 그들은 배낭이 단백질이 잘못된 글자에 닿는 것을 물리적으로 막는다고 추측하지만, 배낭을 장착했을 때 단백질이 어떻게 움직이고 휘어지는지를 정확히 매핑하기 위해서는 더 많은 실험이 필요하다고 말합니다.

또한 그들은 이 방식이 정밀도를 높이는 데는 훌가 뛰어나지만, TadA8e 단백질이 너무 단단하고 안정적이어서 자신들이 시도했던 "빛 스위치" 아이디어에는 잘 반응하지 않는다는 점을 언급했습니다. 그들은 만약 단백질이 조금 더 유연했다면, 미래에 빛으로 이를 제어하는 것이 가능할 수도 있다고 제안했지만, 현재로서는 배낭이 에디터를 더 정밀하고 덜 지저 혹은게 만드는 아주 좋은 방법입니다.

요약하자면, 분자 에디터의 특정 지점에 부피가 크고 불활성인 물체를 붙임으로써, 팀은 속도는 그대로 유지하면서 훨씬 더 신중하고, 마침 \text{침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (침 \ (