Prevalent glutamyl-endopeptidases in the commensal skin microbiome have itch-relevant activity

기술 요약: 공생 피부 미생물군집 내 유병률이 높은 글루타밀-엔도펩티다제의 가려움증 관련 활성

문제 제기
아토피 피부염(AD)은 극심한 소양증(가려움증)과 장벽 기능 장애를 특징으로 하는 만성 염증성 피부 질환이다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 집락 형성은 AD의 중증도 및 가려움증과 강력하게 연관되어 있으나, 상당수의 환자는 S. aureus가 검출되지 않음에도 불구하고 활발한 질환 상태와 가려움증을 경험한다. 알려진 기전은 S. aureus의 V8 프로테아제(글루타밀-엔도펩티다제, GEP)가 감각 신경의 프로테아제 활성 수용체 1(PAR1)을 절단하여 가려움증 신호를 유발하고 상피 장벽 단백질을 분해하는 것이다. 그러나 다른 피부 상주형 스타필로코쿠스(staphylococci), 특히 *표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis)*과 같은 코아굴라제 음성 스타필로코쿠스(CoNS)가 이러한 GEP 매개 병인론에 기여하는지는 여전히 불분명하다.

연구 방법론
본 연구는 다중 오믹스 및 기능적 특성 분석 접근법을 사용하였다:

1. 분리 및 시퀀싱: 저자들은 가려움증을 동반한 10명의 AD 환자로부터 얻은 피부 스왑에서 349개의 박테리아 분리주를 배양하였다. 273개의 스타필로코쿠스 분리주(S. aureus와 S. epidermidis가 주를 이룸)에 대해 Oxford Nanopore 기술을 사용하여 전유전체 시퀀싱(WGS)을 수행하였다.
2. 유전체 마이닝: 알려진 GEP 서열을 사용하여 273개의 게놈을 스크리닝하기 위해 커스텀 은닉 마르코프 모델(HMM)을 구축하였다. 이를 통해 678개의 GEP 후보군을 식별하였다.
3. 구조적 및 기능적 분류: 후보 서열들을 CD-HIT으로 클러스터링하고 신호 펩타이드를 분석하였다. 활성 부위 보존성을 바탕으로 단백질 구조를 예측하기 위해 AlphaFold2를 사용하였으며, 후보들을 다섯 가지의 뚜렷한 구조적 아키텍처(V8, Esp, SplB, Csp, Hsp)로 분류하였다.
4. In Vitro 특성 분석:
   • 발현: 프로테아제를 E. coli에서 이종 발현시키고 thermolysin을 사용하여 효소적으로 활성화하였다.
   • 효소 활성: 합성 기질(Z-FLE-pNA)을 사용하여 배양 상등액과 정제된 재조합 단백질 모두에서 GEP 활성을 측정하였다.
   • PAR1 절단: PAR1 테더드-리간드(tethered-ligand) 구조체(PAR1A22-T102)를 프로테아제와 함께 반응시켰다. 절단 부위를 매핑하고 질량 분석법(LC-MS/MS)을 통해 정량화하였다.
   • 장벽 무결성: 일차 인간 비상피 세포를 활성화된 프로테아제로 처리하였으며, xCELLigence 임피던스 기반 시스템을 통해 시간 경과에 따른 상피 장벽 무결성을 모니터링하였다.
5. 유전적 분포 분석: 환자 분리주 컬렉션과 12,588개의 Staphylococcus 게놈을 포함하는 대규모 공공 데이터베이스에서 BLAST를 사용하여 GEP 상동체의 유병률을 평가하였다.

주요 결과

• GEP의 다양성: 유전체 마이닝 결과 13종의 스타필로코쿠스 종에서 다양한 GEP가 발견되었다. 구조 분석 결과 이들은 다섯 그룹으로 나뉘었으며, S. aureus V8과 S. epidermidis Esp가 가장 높은 구조적 유사성(TM-score ~0.99)을 보였다.
• Esp 및 Csp의 기능적 활성:
  • Esp (S. epidermidis): V8과 유사한 GEP 활성을 나타냈다. 결정적으로, Esp는 글루타밀 잔기(특히 E43)에서 PAR1 테더드 리간드를 절단하여 V8이 생성하는 것과 유사한 비정형(non-canonical) 절단 생성물을 생성하였다.
  • Csp (S. capitis): 중간 정도의 GEP 활성을 보였으며, V8 및 Esp에 비해 효율은 낮았으나 PAR1을 절단하였다.
  • SplB, Hsp: 본 실험 환경의 합성 기질 및 PAR1 구조체에 대해 최소한의 효소 활성을 보였다.
• 장벽 파괴: 활성화된 모든 프로테아제(V8, Esp, SplB, Csp, Hsp)는 세포 모델에서 상피 장벽 무결성을 유의미하게 감소시켰으며, 이는 GEP에 의한 장벽 붕괴가 특정 PAR1 절단 효율과 관계없이 이들 상동체 간의 공통된 특성임을 나타낸다.
• 종 분포:
  • V8: S. aureus에서 고도로 보존됨 (98.9%의 게놈).
  • Esp: S. epidermidis에서 고도로 보존됨 (98.3%의 게놈) 및 S. caprae에 존재함.
  • Csp: S. capitis, S. caprae, S. haemolyticus, S. condimenti에 걸쳐 광범으로 분포함.
  • Hsp: 9개 종에서 발견되는 가장 계통학적으로 광범위한 종임.

의의 및 주장
본 논문은 Esp(S. epidermidis 유래)와 Csp(S. capitis 유래)가 PAR1 가려움증 신호 경로를 활성화하고 상피 장벽 무결성을 파괴할 수 있는 기능적 GEP 병원성 인자임을 확인하였다.

저자들은 다음과 같은 점을 주장한다:

1. 기능적 중복성: AD의 가려움증 및 장벽 기능 장애는 S. aureus에 국한되지 않을 수 있다. 공생 또는 기회감염성 병원체인 S. epidermidis 및 S. capitis는 S. aureus가 없는 상태에서도 GEP 유도 병증을 지속시킬 수 있다.
2. 치료적 시사점: S. aureus만을 표적으로 하는 현재의 치료 전략(예: 특정 항-V8 접근법)은 대안적인 질병 유발 요인을 간과할 수 있다. 여러 스타필로코쿠스 종의 집단적인 단백질 분해 부하(proteolytic load)가 AD 표현형에 기여할 가능성이 높다.
3. 기전적 통찰: 본 연구는 Esp에 의한 PAR1의 비정형 절단이 여전히 작용성(agonistic) 펩타이드를 생성할 수 있음을 입증함으로써, 기존에 S. aureus에 의해서만 발생하는 것으로 여겨졌던 가려움증 신호 축과 S. epidermidis를 직접적으로 연결하였다.

저자들은 향-단계에 대해 신중한 어조를 유지하며, 복잡한 생물학적 시스템(예: 마우스 AD 모델 또는 Esp 전사량의 직접적인 임상적 정량화)에서 이러한 역할을 확인하는 것이 필요한 다음 단계라고 언급하였다. 그러나 현재의 데이터는 비-아우레우스(non-aureus) 스타필로코쿠스의 AD 병인론 참여에 대한 강력한 생화학적 및 유전적 근거를 확립하였다.