Comparison of cell-cycle gene expression dynamics and mRNA kinetics across mouse and human pluripotent systems

기술 요약: 마우스 및 인간 다능성 시스템 간의 세포 주기 유전자 발현 역학 및 mRNA 키네틱스 비교

문제 정의
세포 주기 재구조화(cell-cycle remodeling)는 다능성 및 계통 분화에 필수적이지만, 이러한 과정을 조절하는 전사적 및 포스트 전사적 아키텍처가 종간(마우스 vs 인간) 및 발달 상태(naive vs primed)에 걸쳐 보존되는지는 여전히 불분명하다. 기존 연구들은 DNA 함량 분석이나 생체 리포터를 사용하여 위상 구조(예: naive 상태에서의 단축된 G1기)의 차이를 입증해 왔으나, 이러한 방법들은 게놈 전체의 전사 프로그램을 해결하지 못한다. 반대로, 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 게놈 전체의 발현을 포착하지만, 종종 이산적인(discrete) 위상 할당에 의존한다. 연속적인 세포 주기 진행, 전사, 그리고 mRNA 분해 역학이 다양한 다능성 시스템에서 어떻게 변화하는지에 대한 이해에는 중요한 공백이 존재한다. 구체적으로, 유사한 발현 역학이 서로 다른 기저 키네틱 프로그램으로부터 발생하는 것인지, 아니면 포스트 전사적 조절이 전사적 제어에 비해 안정적인 진화적 백본(backbone) 역할을 하는지는 알려져 있지 않다.

방법론
이러한 질문을 해결하기 위해, 저자들은 scRNA-seq 데이터로부터 연속적인 세포 주기 위상과 위상 의존적 mRNA 키네틱스를 직접 해결하도록 설계된 생물학 정보 기반 딥러닝 프레임워크인 Ciclopes를 도입하였다.

• Ciclopes 아키텍처: 이 도구는 오토인코더(autoencoder)로 기능한다.
  • 인코더(Encoder): 신경망이 유전자 발현 프로파일을 연속적인 세포 주기 위상($\theta$)을 나타내는 1차원 원형 잠재 변수로 매핑한다.
  • 디코더(Decoder): 해석 가능한 푸리에 기반 모델(Fourier-based model)을 사용하여 $\theta$의 함수로서 주기적인 유전자 발현 프로파일을 재구성한다.
  • 초기화: 모델은 확립된 전사 프로그램으로부터 유도된 S–G2/M 매니폴드를 사용하여 위상 순서를 초기화하며, 이를 통해 반복적인 정교화 이전에 생물학적 근거를 확보한다.
  • 키네틱 모델링: 스플라이싱된(spliced) 전사체와 언스플라이싱된(unspliced) 전사체 풍부도가 모두 가용할 때(RNA velocity를 통해), Ciclopes는 추론된 위상을 키네틱 모델과 결합한다. 이 모델은 스플라이싱 속도가 세포 주기와 독립적이라고 가정하면서, 결합된 상미분 방정식(ODEs)을 풀어 유효한 위상 의존적 전사($\alpha$) 및 분해($\gamma$) 속도를 추정한다.
• 데이터 통합: 프레임워크는 여섯 가지의 뚜렷한 다능성 시스템에 적용되었다:
  1. 2i+LIF 및 LIF 조건의 마우스 배아 줄기세포(mESCs).
  2. 마우스 에피블라스트 줄기세포(mEpiSCs).
  3. 인간 Naïve 배아 줄기세포(hNES1).
  4. 인간 배아 줄기세포(hESCs).
  5. 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSCs).
     또한, hiPSC가 결성 내배엽(definitive endoderm)으로 분화하는 타임코스 데이터셋이 분석되었다.
• 전처리: 데이터는 CellRanger 및 velocyto를 사용하여 처리되었다. 저자들은 측정 노이즈를 제거하고 카운트를 정규화하여 마커 발현 및 섀넌 다양성 지수(Shannon diversity indices)의 교차 종 비교를 가능하게 하는 확률적 디노이징 프레임워크인 Sanity를 사용하였다.

주요 결과

1. 분산된 전사 전략:

   • 마우스 시스템: 핵심 세포 주기 조절 인자의 높은 기저 발현(baseline expression)을 보인다.
   • 인간 시스템: 높은 기저 발현을 더 큰 진폭의 진동(oscillatory amplitudes)과 맞교환한다.
   • 위상 분포: 인간 시스템은 일반적으로 마우스 시스템에 비해 G1기에 있는 세포의 비율이 높다. Primed 상태(mEpiSCs, hESCs, hiPSCs)는 naïve 상태에 비해 높은 G1 분율을 보이지만, hiPSC는 낮은 G1 분율을 가진 예외였다.
   • 상태의 연속체: 다능성 마커의 주성분 분석(PCA) 결과, 이산적인 클러스터보다는 연속적이고 중첩되는 분포가 나타났으며, 이는 naïve와 primed 정체성이 이진 상태가 아닌 하나의 경사(gradient) 상에 존재함을 시사한다.

2. 포스트 전사적 키네틱스의 보존:

   • 전사 타이밍과 진폭은 시스템 전반에 걸쳐 크게 달랐지만, mRNA 분해의 타이밍은 상당히 더 보존되어 있었다.
   • 원형 상관관계 분석(Circular correlation analysis) 결과, 분해 프로파일은 종과 상태 전반에 걸쳐 매우 일치하는 반면, 전사 타이밍은 더 큰 분산을 보였다. 이는 포스트 전사적 조절이 진화적으로 안정적인 백본 역할을 하는 반면, 전사 프로그램은 더 가소적(plastic)이고 맥락 의존적임을 시사한다.

3. 계통 분화 중의 역학 (hiPSC에서 내배엽으로):

   • 세포가 결성 내배엽으로 분화함에 따라, 활발히 순환하는 세포의 집단이 감소하였으며, 상당 부분의 세포가 세포 주기를 탈출(정지 상태가 됨)하였다.
   • 남아있는 순환 세포 집단은 더 긴 G1기로 이동하였다.
   • 세포 주기에 결합된 유전자의 수는 급격히 감소하였다 (Day 1의 약 4,500개에서 Day 3의 약 1,100개로).
   • 결정적으로, 생존한 세포 주기 조절 인자들은 마우스(높은 기저 발현)와 인간(높은 진폭) 시스템을 비교할 때 관찰된 패턴과 유사하게, 높은 기서 발현에서 더 큰 진동 진폭으로의 전환을 보였다.

의의 및 주장
본 논문은 다능성 세포가 진화적 및 발달적 전이 과정에서 증식을 어떻게 미세 조정하는지 해부하기 위한 일반적인 프레임워크를 구축했다고 주장한다. 주요 의의는 세포 주기 조절이 고정된 보편적 프로그램이 아니라, 기저 발현과 진동 진폭의 뚜렷한 조합을 통해 구현되는 미세 조정 가능한 프로그램이라는 발견에 있다.

저자들은 세포 주기 제어의 계층적 모델을 제시한다:

• 안정적 층(Stable Layer): mRNA 분해 역학은 보존되고 진화적으로 안정된 기질을 형성한다.
• 가소적 층(Plastic Layer): 맥락 의존적인 전사 프로그램이 이 안정적인 백본 위에 중첩되어 종의 정체성, 배양 조건, 계통 분화에 적응한다.

이 연구는 "다능성 줄기세포"를 단일한 참조 상태로 취급하는 것에 반대하며, 세포 주기 역학에 대한 시스템별 해부의 필요성을 강조한다. Ciclopes를 제공함으로써, 저자들은 연속적인 세포 주기 조절을 해결하는 정량적 도구를 제시하며, 종 및 발달 차이가 단순히 특정 마커의 존재 여부가 아니라 유전자 발현의 정량적 체제(quantitative regimes)에 반영된다는 점을 밝혀냈다. 이러한 결과는 세포가 더 전문화됨에 따라(진화적 분화 또는 계통 분화를 통해), 특정 유전자 프로그램의 대사 요구를 수용하기 위해 세포 주기 조절 인자에 대해 더 엄격하고 시간 제한적인 통제를 가할 가능성이 있음을 시사한다.