Single-cell and spatial profiling of cysteine cathepsins identifies tumor states relevant to antibody-drug conjugates in breast cancer

기술 요약: 유방암에서 항체-약물 접합체(ADC)와 관련된 종양 상태를 식별하기 위한 단일 세포 및 공간 프로파일링

문제 제기
유방암은 악성, 면역 및 기질 구획 간의 복잡한 상호작용에 의해 종양 진행과 치료 반응이 결정되는 매우 이질적인 질환이다. 시스테인 카텝신(B, L, S, D)과 레구메인(legumain)은 조직 재구성, 면역 기능 및 프로테아제 절단형 항체-약물 접합체(ADC)의 세포 내 가공을 조절하는 것으로 알려져 있으나, 인간 유방암 내에서의 정확한 세포 분포와 기능적 활성은 여전히 완전히 정의되지 않았다. 현재의 ADC 바이오마커 전략은 주로 표적 항원 발현(예: HER2)에만 의존하며, 이는 프로테아제 절단형 약물 방출에 필요한 적합한 세포 내 단백질 분해 환경을 간과할 가능성이 있다. 또한, 표준 발현 프로파일링은 총 단백질 풍부도와 촉매 활성을 가진 효소를 구분하지 못하는데, 이는 시스타틴(cystatins)과 같은 내인성 억제제에 의한 프로테아제의 엄격한 조절을 고려할 때 매우 중요한 차이다.

방법론
저자들은 조직 병리학적으로 확진된 66명의 유방암 환자를 대상으로 통합 연구를 수행하였다. 워크플로우는 전신 면역 프로파일링과 고해상도 종양 내 분석을 결কে하였다:

1. 전신 프로파일링: 66명 전원의 말초 혈액 백혈구를 프로테아제(카텝신 B, L, S, D, 칼파인-1) 및 표준 면역 마커를 포함하는 패널을 사용하여 질량 세포 분석법(CyTOF)으로 분석하였다. 혈장은 다중 비드 분석법을 사용하여 수용성 매개체(사이토카인, 케모카인)를 프로파일링하였다.
2. 단일 세포 종양 프로파일링: 55명의 환자로부터 분리된 종양 조직을 종양 구조(상피, 기질, 내피), 면역 구획, 세포 사멸 마커, 그리고 포괄적인 프로테아제 및 그 내인성 억제제(시스타틴 B, C, E/M)를 표적으로 하는 커스텀 패널을 사용하여 CyTOF로 분석하였다.
3. 공간 프로파일링 (IMC): 포르말린 고정 파라핀 매립(FFFF) 조직 절편을 이미징 질량 세포 분석법(IMC)을 사용하여 프로테아제의 공간적 분포를 조직 구조 및 면역 니치(niche)와 관련하여 매핑하였다.
4. 활성 기반 이미징: OCT 매립 조직 절편의 일부를 활성 카텝신 B에 선택적인 질량 세포 분석 호환성 활성 기반 프로브(TOF-120)로 염색하였다. 특이성은 범-카텝신 억제제 E64에 의한 전처리를 통해 검증되었다.
5. 기능적 검증: 세 가지 유방암 세포주(BT-474, MCF-7, MDA-MB-231)를 사용하여 다양한 링커 특이성(범-카텝신, 카텝신 B 선택적, 카텝신 L 선택적)을 가진 HER2 표적 ADC의 효능을 MTS 분석을 통해 테스트하였다.

주요 기여 및 결과

• 전신 면역 계층화: 말초 혈액의 비지도 학습 분석을 통해 두 개의 뚜렷한 환자 클러스터를 식별하였다. 클러스터 1은 선행 보조 화학요법(NAT)을 받는 환자와 높은 림프절 상태를 가진 환자가 풍부했으며, 클러스터 2에 비해 낮은 림프구 대 단핵구 비율과 감소된 특정 사이토카인 수치를 보였다. 이는 전신 면역 구성이 분자적 아형보다 치료 노출 및 종양 공격성을 더 효과적으로 포착함을 시사한다.
• 세포 유형별 프로테아제 모듈: 단일 세포 종양 프로파일링 결과, 프로테아제 발현은 무작위로 분포하기보다 재현 가능한 세포 유형 관련 모듈로 조직되어 있음이 밝혀졌다.
  • 카텝신 B/L 및 시스타틴 C: 이들은 종양 침윤 면역 세포(특히 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 대식세포)에서 풍부하게 나타나는 견고한 축을 형성하였으며, 상피 세포에서도 가변적으로 발현되었다.
  • 레구메인 및 시스타틴 E/M: 이들은 여러 세포 집단에 걸쳐 강한 공존 현상을 보였다.
  • 카텝신 S: 주로 항원 제시 세포 유사 집단에 국한되었다.
  • 카텝신 D: 종양 세포 전반에 걸쳐 광범적으로 분포하였다.
  • 결정적으로, 면역 세포에서의 높은 카텝신 발현은 유방암 아형이나 이전 NAT와 상관관관계가 없었으며, 이는 이러한 단백질 분해 프로그램이 종양 고유의 지문이라기보다는 안정적인 세포 상태 모듈(예: 대식세포 성숙)을 반영함을 시사한다.
• 상피 세포에서의 표적과 프로테아제의 디커플링(Decoupling): 상피 종양 세포에서 높은 HER2 발현이 높은 카텝신 B 또는 L 풍부도와 일관되게 일치하지는 않았다. 저자들은 높은 HER2와 높은 카텝신 B를 모두 특징으로 하는 좁은 하위 그룹(코호트의 13%)을 식별하였으며, 이는 "표적 전용" 선택이 프로테아제 절단형 ADC에는 불충분할 수 있음을 시사한다.
• 공간적 국소화: IMC는 프로테아제가 공간적으로 조직되어 있음을 입증했다. 카텝신 B는 종양-기질 경계면과 대식세포가 풍부한 니치에서 농축되었으며, 카텝신 D는 광범하게 분포했다. 카텝신 B 활성은 특히 대식세포가 풍부한 영역과 지방세포 경계면에 국한되었다.
• 개념 증명 활성 이미-징: 본 연구는 인간 유방암 조직에서 TOF-프로브를 사용하는 IMC의 타당성을 성공적으로 입증했다. 카텝신 B 선택적 프로브(TOF-120)는 조직 절편 내 활성 효소를 표지하였으며, E64 전처리에 의해 신호가 소실됨으로써 이 방법이 총 단백질 풍부도가 아닌 촉매 활성 효소를 검출함을 확인하였다.
• ADC 효능 상관관계: 인 비트로(In vitro) 실험은 HER2 표적 ADC가 효능을 발휘하기 위해 표적 발현이 필요함을 확인했다. 그러나 연구는 프로테아제 절단형 링커(Val-Cit 등)가 카텝신에 의해 세포 외에서 절단될 수 있어, 바이스탠더 효과(bystander effect)나 오프 타겟 독성을 유발할 수 있음을 강조하며, 프로테아제 맥락을 이해하는 것의 중요성을 뒷받침했다.

의의 및 주장
본 논문은 전신 면역 상태와 종양 내 단백질 분해 프로그램을 연결하는 "시스테인 카텝신 중심의 단일 세포 및 공간적 유방암 관점"을 제공한다고 주장한다. 주요 의의는 다음과 같다:

1. 프로테아제 활성의 맥락 의존성: 프로테아제의 기능적 출력은 기질 접근성, 활성화, 그리고 시스타틴에 의한 억제를 포함하는 역동적인 "프로테아제 웹(web)"에 의해 결정된다. 따라서 발현 수준만으로는 단백질 분해 능력을 예측하기에 불충분하다.
2. 정밀한 환자 계층화: 표적 항원 발현(예: HER2)을 프로테아제 풍부도, 프로테아제 활성 또는 리소좀 상태(예: LAMP-1)와 통합함으로써 프로테아제 절단형 ADC를 위한 환자 선택을 개선할 수 있다. 저자들은 최적의 후보군이 HER2 상태만으로 식별된 집단보다 더 좁은 하위 집단임을 제안한다.
3. 방법론적 발전: 본 연구는 "액티보옴(activome) 기반" 공간 종양 프로파일링의 토대를 마련했다. IMC와 활성 기반 프로브를 결합함으로써, 연구자들은 이제 정적인 단백질 풍부도를 넘어 인간 조직 내에서 촉매 활성을 가진 효제를 직접 조사하고 기능적 상태를 매핑할 수 있게 되었다.

저자들은 이러한 발견이 바이오마커-프로테아제 쌍을 기반으로 한 차세대 ADC 선택 전략 개발을 지원하며, 이를 통해 프로테아제 활성화 표적 치료의 혜택을 받을 가능성이 가장 높은 환자를 식별할 수 있다고 결론지었다.