Smartphone-assisted read result colorimetric and fluorescent dual readout mode immunosensor for the detection of ochratoxin A  based on MnO2NS-TMB

기술 요약: 오크라톡신 A 검출을 위한 스마트폰 보조 이중 판독 면역센서

문제 제기
Aspergillus 및 Penicillium 균류에 의해 생성되는 독성 대사물질인 오크라톡신 A(OTA)는 유전독성, 신독성 및 발암성을 포함한 심각한 건강 위험을 초러합니다. 이는 레드 와인, 곡물, 커피와 같은 식품을 빈번하게 오염시킵니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 HPLC-MS/MS와 같은 기존의 검출법은 높은 정확도를 제공하지만, 복잡한 조작, 높은 비용 및 전문 장비의 필요성으로 인해 대규모 또는 현장 스크리닝에는 부적합합니다. 형광, 비색, 전기화학적 방식의 바이오센서들이 대안으로 등장했으나, 많은 센서가 여전히 제한된 민감도나 단일 신호 출력에 의존하여 견고성이 부족하다는 문제를 안고 있습니다. 결과의 교차 검증을 수행할 수 있는 휴대 가능하고 민감하며 신뢰할 수 있는 검출 시스템에 대한 절실한 필요성이 존재합니다.

방법론
저자들은 이산화망간 나노시트(MnO2NS)의 산화환원 활성을 기반으로 한 이중 판독 모드(비색 및 형광)를 활용하여 스마트폰 보조 면역센서를 개발했습니다. 이 시스템은 간접 경쟁 면역 분석 원리로 작동합니다:

1. 면역 분석 메커니즘: 소 혈청 알부민 결합 OTA(BSA-OTA)를 마이크로플레이트에 고정합니다. 샘플 내의 자유 OTA는 단클론 항체(McAb)의 결합 부위를 두고 BSA-OTA와 경쟁합니다. 그 후 알칼리성 인산분해효소(ALP)가 표지된 이차 항체(IgG-ALP)를 첨가하여 삼원 복합체를 형성합니다.
2. 신호 생성: ALP 효소는 2-포스포-L-아스코르브산(AAP)의 가수분해를 촉매하여 아스코르브산(AA)을 생성합니다. 생성된 AA의 농도는 샘플 내 OTA 농도와 반비례합니다.
3. 산화환원 반응: 생성된 AA는 MnO2NS를 환원시킵니다. 남은(환원되지 않은) MnO2NS는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 산화시켜 청색의 산화된 TMB(oxTMB)를 형성합니다.
   • 비색 신호: 청색의 강도(스마트폰 카메라의 블루 채널을 통해 측정)는 잔류 MnO2NS 양에 비례하며, 따라서 OTA 농도와는 반비례 관계에 있습니다.
   • 형광 신호: 로다민 B(RhB)가 시스템에 첨가됩니다. oxTMB의 UV-vis 흡수는 RhB의 형광 방출과 중첩되어 내부 필터 효과(IFE)를 통해 형광을 소광(quenching)시킵니다. 결과적으로, 높은 OTA 수준(더 적은 AA 생성, 더 적은 MnO2NS 분해, 더 많은 oxTMB 생성)은 더 큰 형광 소광을 초래합니다.

주요 기여

• 이중 판독 전략: 본 연구는 비색 및 형광 검출을 단일 플랫폼에 통합하여 결과의 신뢰성을 높이기 위한 교차 검증을 가능하게 합니다.
• 스마트폰 통합: 비색 판독은 스마트폰과 무료 소프트웨어(Spotxel Reader)를 사용하여 캡처 및 분석되므로, 벌키한 장비 없이도 신속한 현장 검출을 용이하게 합니다.
• MnO2NS-TMB-RhB 시스템: 본 연구는 MnO2NS의 특이적 산화환원 특성과 oxTMB와 RhB 사이의 내부 필터 효과를 활용하며, 이는 이전의 OTA 검출 연구에서 광범위하게 탐구되지 않은 조합입니다.

결과

• 성능 지표:
  • 비색 모드: 1.07 ng/mL의 검출 한계(LOD)와 2–40 ng/mL의 선형 범위를 달로 달성했습니다.
  • 형광 모드: 0.59 ng/mL의 더 낮은 LOD와 2–120 ng/mL의 더 넓은 선형 범위를 달성했습니다.
  • 두 모드 모두 높은 선형성($R^2 > 0.97$)을 보여주었습니다.
• 특이성: 센서는 OTA에 대해 높은 특이성을 보였으며, 타겟 OTA 농도의 100배 농도에서도 다른 마이코톡신(T-2, FB1, PAT, AFB2, DON)의 간섭이 미미했습니다.
• 실제 샘플 분석: OTA가 첨가된 레드 와인 샘플에 적용했을 때, 센서는 92.85%–102.85%(비색) 및 98.20%–107.88%(형광)의 회수율을 나타냈으며, 변동 계수(CV)는 5% 미만이었습니다.
• 비교: 본 센서의 민감도는 와인 내 OTA에 대한 유럽 연합 규제 한도(2 ng/mL)를 충족하며, LOD 및 판독성 측면에서 기존의 나노물질 기반 방법들과 유리하게 비교됩니다.

의의
본 논문은 이 이중 모드 면역센서가 레드 와인의 OTA 잔류물 검출을 위한 새로운 기준을 제공한다고 주장합니다. 두 가지 신호 출력 간의 교차 검증을 가능하게 함으로써, 이 시스템은 단일 모드 센서에 비해 검출 결과의 신뢰성을 크게 향상시킵니다. 스마트폰 기술의 통합은 휴대 가능하고 비용 효율적이며 고처리량의 스크리닝 도구에 대한 요구를 해결하여, 식품 안전 감시 및 공중 보건 보호를 위한 유망한 방법론적 접근을 제공합니다. 저자들은 이 연구가 전통적인 실험실 기반 분석의 한계를 극념하는 더욱 견고한 현장 검출 방법을 향한 단계라고 보고 있습니다.