High-resolution cryoEM structure determination of soluble proteins after soft-landing electrospray ion beam deposition

Deze studie introduceert een nieuwe methode voor cryo-EM van oplosbare eiwitten via soft-landing electrospray ion beam deposition (ESIBD), die het mogelijk maakt om chemisch geselecteerde monsters met hoge resolutie (2,5–4,8 Å) in beeld te brengen en zo directe correlaties tussen native massaspectrometrie en structurele details bloot te leggen.

De kern

De Kern: Een "Vliegveld" voor Moleculen

Stel je voor dat je een heel delicate, complexe pop (een eiwit) wilt fotograferen. Normaal gesproken doe je dit door de pop in een blokje ijs te bevriezen (zoals in een vriezer) en dan onder een microscoop te kijken. Maar deze nieuwe methode, ontwikkeld door onderzoekers in Oxford, is meer als een luchthaven voor moleculen.

Ze gebruiken een techniek die ESIBD heet. In plaats van de pop in een ijsblok te gooien, vangen ze de poppen op in de lucht (in een vacuüm), sorteren ze op gewicht en laten ze ze zachtjes "landden" op een heel klein platform.

Hoe werkt het? (De 3 Stappen)

1. De Vliegveld-Start (Massa-selectie):
   De eiwitten worden eerst verdampt tot een wolk van geladen deeltjes (zoals een mist van kleine ballonnen). De onderzoekers gebruiken een magische filter (een massa-spectrometer) om alleen de perfecte, schone ballonnen te selecteren. Alle vuil, stof of verkeerde ballonnen worden weggegooid. Zo krijgen ze een 100% schone lading van precies hetzelfde eiwit.

   • Vergelijking: Het is alsof je een grote groep mensen door een poort laat lopen en alleen de mensen met een specifiek paspoort en geen vlekken op hun kleding doorlaat.

2. De Zachte Landing:
   Deze geselecteerde eiwitten worden dan heel voorzichtig op een koude plaat gelaten. Ze moeten niet hard landen (anders breken ze), maar moeten als een veer zachtjes neerkomen.

   • Vergelijking: Het is alsof je een ei van een hoog raam laat vallen, maar je vangt het op een kussen van veren in plaats van op beton.

3. Het Ijs-Blanket (De Magische Stap):
   Dit is het nieuwe en belangrijke deel. Nadat de eiwitten op de plaat liggen, laten de onderzoekers heel voorzichtig waterdamp neerslaan. Dit vormt een ultradunne laag van "glazen ijs" (amorf ijs) om de eiwitten heen.

   • Waarom? Zonder dit ijs zijn de eiwitten in het vacuüm droog en vervormd. Het ijs werkt als een beschermend glas dat de eiwitten in hun oorspronkelijke vorm houdt, zodat ze eruitzien zoals ze in het menselijk lichaam doen.

Wat hebben ze ontdekt? (De "Droogte" en de "Vorm")

Toen ze de foto's maakten, zagen ze iets fascinerends:

• Het binnenste is perfect: Het hart van het eiwit (de kern) ziet er nog steeds prachtig uit, met alle details scherp.
• Het buitenste is een beetje "slordig": De buitenkant van het eiwit is wat veranderd.

De Vergelijking:
Stel je een spons voor die je uit het water haalt.

• Het binnenste van de spons blijft stevig en behoudt zijn vorm.
• De buitenkant die in contact kwam met de lucht, krimpt en plakt een beetje aan elkaar omdat het water weg is.

In dit experiment zagen ze precies dit: De delen van het eiwit die normaal gesproken veel water aanraken (het buitenste), krompen een beetje of verplaatsten zich toen het water weg was. De delen die diep van binnen zaten en nooit water zagen, bleven perfect.

Waarom is dit geweldig nieuws?

Vroeger was het moeilijk om twee dingen tegelijk te doen:

1. Weten exact welk eiwit je hebt (chemische zuiverheid).
2. Een super-scherpe foto maken van hoe het eruitziet (structuur).

Deze nieuwe methode combineert het beste van twee werelden:

• Je kunt kiezen welke eiwitten je wilt (zoals een DJ die alleen de beste nummers draait).
• Je krijgt super-scherpe foto's (tot op atomaire niveau) van die gekozen eiwitten.

Conclusie in één zin

De onderzoekers hebben een nieuwe manier bedacht om eiwitten als een zachte, gezuiverde lading op een koude plaat te laten landen en ze vervolgens in een beschermend ijs-blanket te verpakken, zodat we voor het eerst heel precies kunnen zien hoe deze moleculen eruitzien, zelfs als ze een beetje zijn veranderd door het droge proces.

Dit opent de deur om ziektes beter te begrijpen en nieuwe medicijnen te ontwerpen, omdat we nu de "chemische identiteit" en de "fysieke vorm" van eiwitten perfect aan elkaar kunnen koppelen.

Technische samenvatting

Probleemstelling

De integratie van chemische informatie uit massaspectrometrie (MS) met structurele informatie van hoge resolutie uit cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) is een langdurig doel in de moleculaire biologie. Hoewel native MS uitstekend is in het bepalen van stoichiometrie en interacties, en cryoEM near-atomaire structuren kan opleveren, zijn deze methoden traditioneel gescheiden.

• Beperkingen van bestaande methoden: CryoEM vereist vaak uitgebreide zuivering om homogene monsters te verkrijgen, wat de chemische diversiteit beperkt die met MS kan worden gemapt.
• Uitdagingen bij ESIBD: Eerdere pogingen om soft-landing electrospray ion beam deposition (ESIBD) te combineren met cryoEM (voor het eiwit $\beta$-Galactosidase) toonden aan dat hoewel de secundaire structuur behouden bleef, er sprake was van resolutieverlies aan het oppervlak door uitdroging. De embedding in ijs was inconsistent (polykristallijn ijs met variabele dikte), en de overdracht van het monster naar de cryoEM was gevoelig voor contaminatie en devitrificatie (smelten van het amorf ijs).

Methodologie

De auteurs hebben een nieuwe, geoptimaliseerde instrumentatie en workflow ontwikkeld voor ESIBD-gestuurde cryoEM-monsterbereiding van oplosbare eiwitten.

1. Instrumentatie:

   • Een aangepaste Thermo Scientific Q Exactive UHMR massaspectrometer werd uitgebreid met twee differentieel gepompte kamers die leiden tot ultrahoog vacuüm (UHV, $p < 10^{-9}$ mbar).
   • Een speciaal ontworpen cryogene depositiestage met een cryoshuttle (compatibel met Aquilos-transferhardware) zorgt voor contaminatievrije overdracht.
   • De ionenbundel wordt massaselectief gefilterd en geleid via elektrostatische lenzen naar de sample.

2. Processtappen:

   • Zachte Ionisatie: Eiwitten worden opgelost in ammoniumacetaat (pH 6,9) en geïoniseerd via native nano-ESI onder zeer zachte omstandigheden (lage temperatuur, geen desolvatie-spanning) om de native fold te behouden.
   • Massaselectie: Onzuiverheden en ongewenste oligomeren worden verwijderd via een quadrupool-filter.
   • Soft-Landing Depositie: De geselecteerde ionen worden met een zeer lage landingsenergie (1–2 eV per lading) op cryoEM-grids (bedekt met amorfe koolstof) gedeponeerd in UHV. De gridtemperatuur wordt gehouden op 115 K.
   • Gecontroleerde IJsgroei: Na depositie wordt een dunne, homogene, vitreuze ijsfilm (10–50 nm) gekweekt door waterdamp in te laten bij een gedefinieerde partiële druk en temperatuur (115 K). Dit is cruciaal om kristallijn ijs of nanostructuren te voorkomen.
   • Overdracht: Het monster wordt gekoeld tot 93 K en via een gesloten cryoshuttle overgebracht naar vloeibare stikstof, waarbij devitrificatie en contaminatie worden voorkomen.

3. Data-analyse:

   • De monsters werden afgebeeld op een Krios cryo-TEM.
   • Er werd een "solvent exposure score" ontwikkeld om de correlatie tussen de oplosmiddelblootstelling in de native structuur en de lokale resolutie in de cryoEM-kaarten te kwantificeren.

Belangrijkste Bijdragen

• Generaliseerbare Workflow: Het bewijzen dat ESIBD+cryoEM een robuuste methode is voor diverse oplosbare eiwitcomplexen, niet beperkt tot één modelproteïne.
• Geoptimaliseerde IJsgroei: De ontwikkeling van een methode voor het kweken van perfecte, amorfe ijsfilms in vacuüm, wat essentieel is voor hoge resolutie.
• Koppeling Chemische en Structurele Data: Het direct verbinden van chemische selectiviteit (via MS) met near-atomaire structurele resolutie, waardoor monsters met specifieke stoichiometrie of ligandbinding kunnen worden bestudeerd zonder zuiveringsverlies.

Resultaten

De methode werd succesvol toegepast op vier eiwitcomplexen: $\beta$-Galactosidase, Glutamaatdehydrogenase (GDH), RuBisCo en GroEL.

• Resolutie: De workflow leverde cryoEM-kaarten op met een resolutie van 2,5 Å tot 4,8 Å, wat voldoende is voor het bouwen van atomaire modellen.
• Structuurbehoud en Veranderingen:
  • De secundaire en tertiaire structuur bleven grotendeels behouden.
  • Correlatie met Oplosmiddelblootstelling: Er werd een sterke correlatie gevonden tussen de lokale resolutie en de blootstelling aan oplosmiddel in de native staat.
    • Interne residuen: Toonden hoge resolutie (dichte elektronendichtheid).
    • Oppervlakteresiduen: Toonden lagere resolutie of ontbrekende dichtheid. Deze gebieden ondergaan herordening door het verlies van water-water en water-eiwit interacties tijdens de uitdroging.
• Coherente vs. Incoherente Veranderingen:
  • Coherente veranderingen: Gebieden die zich op een voorspelbare manier herschikken (bijv. het sluiten van spleten in $\beta$-Galactosidase of het verdraaien van ringen in GroEL) behouden hoge resolutie. GroEL onderging bijvoorbeeld een 24% inkrimping in hoogte.
  • Incoherente veranderingen: Gebieden met hoge flexibiliteit en grote oplosmiddelblootstelling (zoals de "antennes" van GDH) vertoonden heterogeniteit, wat leidde tot resolutieverlies omdat er geen enkele voorkeursconformatie ontstond.

Betekenis en Conclusie

Dit onderzoek vestigt ESIBD gecombineerd met cryoEM als een levensvatbare en krachtige methode voor structurele biologie.

• Unieke Voordelen: Het stelt onderzoekers in staat om chemisch geselecteerde monsters (bijv. specifieke oligomeren of ligand-complexen) direct te visualiseren zonder de noodzaak van traditionele zuivering die vaak de native staat verstoort.
• Inzicht in Gasfase-dynamica: De studie biedt een microscopisch inzicht in hoe eiwitten reageren op uitdroging. Het toont aan dat structuurveranderingen voorspelbaar zijn op basis van de oplosmiddelblootstelling en dat de vorming van nieuwe intramoleculaire interacties de drijvende kracht is achter de compactie.
• Toekomstperspectief: De techniek opent de deur voor het bestuderen van membraaneiwitten en het integreren van gasfase-structuurinformatie met native MS-data, wat nieuwe inzichten kan bieden in eiwitdynamica en interacties die in oplossing moeilijk waar te nemen zijn.