An Instrument for Physical Vapor Deposition onto Cryo-EM Samples for Microsecond Time-Resolved Cryo-EM

Dit artikel presenteert het ontwerp en de werking van een apparaat voor fysische dampdepositie voor cryo-EM-monsters dat microseconde-tijdsopgeloste experimenten mogelijk maakt door verbindingen op bevroren roosters af te zetten voor daaropvolgende laserflitssmelting, waarbij de bruikbaarheid wordt aangetoond bij het optimaliseren van afdichtingsmembranen en het opstarten van proteïnedynamiek.

De kern

Stel je voor dat je een hoogwaardige foto probeert te maken van een eiwit, de kleine machine in onze cellen die al het werk doet. Normaliter moeten wetenschappers om deze foto's te maken met een elektronenmicroscoop het eiwit direct invriezen, alsof ze een vlieg in de lucht flash-freezen. Dit heet Cryo-EM.

Er is echter een probleem: eenmaal bevroren zit het eiwit vast. Het kan niet bewegen, dus je kunt niet zien hoe het werkt. Onlangs hebben wetenschappers uitgevonden hoe ze deze bevroren monsters voor slechts een heel klein deel van een seconde (microseconden) kunnen "flash-smelten" en ze vervolgens direct weer direct bevriezen. Hierdoor kunnen ze het eiwit midden in een beweging vastleggen, net als het maken van een foto van een danser halverwege een sprong.

Maar er was een addertje onder het gras. Als je het ijs smelt, drijft het eiwit in een klein druppeltje water. Als die druppel de lucht raakt, blijft het eiwit aan het oppervlak plakken en kan het niet vrij ronddraaien, waardoor het moeilijk is om het vanuit alle hoeken te zien. Ook, als je wilt onderzoeken hoe een eiwit reageert op een nieuwe chemische stof (zoals een medicijn), kun je de chemische stof niet zomaar over een bevroren monster gieten; het zal niet mengen.

De Oplossing: Een "Vacuümverfspuit" voor Bevroren Monsters

Dit artikel beschrijft een nieuwe machine die is gebouwd om deze problemen op te lossen. Denk eraan als een high-tech, vacuüm afgesloten spuitcabine die specifiek is ontworpen voor bevroren microscoopglaasjes.

Hier is hoe het werkt, met behulp van eenvoudige analogieën:

1. De "Sandwich"-Techniek (Het Monster Afdichten)
Stel je voor dat je bevroren eiwit een kwetsbare sandwich is. Normaal zijn de boven- en onderkant open voor de lucht. De nieuwe machine kan een ongelooflijk dunne laag "glas" (siliciumdioxide) spuiten op de boven- en onderkant van de sandwich terwijl deze nog bevroren is.

• Waarom doen? Het sluit het water binnen zodat het niet verdampt wanneer het smelt. Het duwt het eiwit ook weg van de lucht, waardoor het vrij kan ronddraaien wanneer de laser het ijs smelt.
• De Ontdekking: De wetenschappers testten hoe dun dit "glas" kon zijn. Ze ontdekten dat als het glas te dun is (minder dan twee atoomlagen), het kleine gaatjes heeft en het water lekt. Maar als het net iets meer dan twee lagen dik is, houdt het perfect. Dit is de dunst mogelijke "afdichting" die ze kunnen gebruiken.

2. De "Magisch Stof"-Techniek (Chemische Stoffen Maken)
Stel je voor dat je een bevroren taart hebt en je wilt zien wat er gebeurt als je chocoladevlokken toevoegt, maar je kunt de taart niet eerst laten smelten.

• De Oude Manier: Dit kon je eigenlijk niet doen met bevroren monsters.
• De Nieuwe Manier: Deze machine kan een fijn stofje van chemicaliën (zoals calciumzouten) spuiten op het bevroren monster. Het stofje ligt bovenop en wacht.
• De Trigger: Wanneer de wetenschappers het monster raken met een laserpuls om het een fractie van een seconde te laten smelten, verandert het ijs in water en lost het "stofje" direct op en mengt het met het eiwit.
• Het Bewijs: De wetenschappers testten dit door calciumstof te spuiten op een monster dat een speciale kleurstof bevatte die rood oplichtte. Toen de laser het ijs smolt, mengde het calcium zich met de kleurstof en werd de gloed zwakker. Dit bewees dat de chemicaliën in een oogwenk perfect mengden.

Waarom Dit Belangrijk Is
Deze machine is als een universele afstandsbediening voor bevroren biologie. Het stelt wetenschappers in staat om:

1. Het monster te beschermen zodat het niet verdampt of vast komt te zitten.
2. Ingrediënten (zoals medicijnen of chemicaliën) toe te voegen aan het monster nadat het is bevroren maar voordat het experiment begint.
3. Alles direct te mengen door een laser te gebruiken om het ijs te smelten, waardoor de reactie precies op het moment wordt getriggerd dat ze willen kijken.

De auteurs suggereren dat deze machine de standaard "keuken" kan worden voor toekomstige experimenten, waar wetenschappers complexe, meerstaps experimenten kunnen opbouwen door af te wisselen tussen het toevoegen van ingrediënten en het flash-smelten van het monster, allemaal zonder het monster ooit uit de machine te halen.

Samenvattend
Het artikel introduceert een hulpmiddel dat wetenschappers in staat stelt bevroren monsters te "beschilderen" met beschermend glas of chemisch stof. Wanneer ze het monster raken met een laser, smelt het ijs, verandert de verf in een vloeistof en mengen de chemicaliën direct. Hierdoor kunnen ze eiwitten in real-time zien bewegen en reageren, waardoor het probleem wordt opgelost hoe ingrediënten in een fractie van een seconde met een bevroren monster kunnen mengen.

Technische samenvatting

Technische Samenvatting: Een Instrument voor Fysische Vapor Deposition op Cryo-EM-monsters voor Microseconde Tijdopgeloste Cryo-EM

Probleem en Context
Microseconde tijdopgeloste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) gebaseerd op laserflits-smelten heeft recentelijk waarneming van eiwitbewegingen op de microseconde-tijdschaal mogelijk gemaakt. Deze techniek omvat het kortstondig smelten van een bevroren monster met een laserpuls om dynamiek op te wekken, gevolgd door snelle revitrificatie om tijdelijke configuraties vast te leggen. Hoewel deze aanpak de temporele resolutie van cryo-EM heeft uitgebreid, heeft het ook nieuwe kansen voor monsterbereiding blootgelegd. Specifiek biedt de mogelijkheid om verbindingen op bevroren monsters af te zetten voorafgaand aan flits-smelten een methode om de monsteromgeving dynamisch te veranderen. Eerdere werken toonden aan dat het afzetten van amorfe ijs of siliciumdioxide-membranen de voorkeursoriëntatie van deeltjes kon mitigeren door deeltjes te scheiden van het lucht-water-interface. Een speciaal instrument om fysische vapor deposition (PVD) van niet-vluchtige verbindingen direct op cryo-EM-monsters uit te voeren binnen een vacuümomgeving ontbrak echter, wat de mogelijkheid beperkte om reagentia in te brengen of ultradunne vloeistofcelgeometrieën voor deze experimenten te creëren.

Methodologie
De auteurs beschrijven het ontwerp en de werking van een aangepast vacuüminstrument dat is ontworpen voor fysische vapor deposition op cryo-EM-monsters. Het instrument is voorzien van een vacuümkamer van roestvrij staal met zes openingen, evacueerd tot $3 \times 10^{-8}$ mbar. Cryo-EM-monsters worden geladen via een hergebruikt load-lock-systeem van een JEOL 2010 transmissie-elektronenmicroscoop, geïntegreerd in een gemotoriseerde rotatiestage. Deze opstelling maakt het mogelijk om de monsterhouder te roteren, waardoor depositie aan één of beide zijden van het monster mogelijk is.

Het systeem ondersteunt twee depositiemodi:

1. Gastoevoer: Vluchtige verbindingen worden ingebracht via een gastoevoerklep, waardoor gelijktijdige depositie aan beide zijden van het monster mogelijk is.
2. Elektronenstraalverdamping: Verbindingen met lage dampdruk worden afgezet met een elektronenstraalverdampingsapparaat. Het systeem maakt gebruik van een tantalumkruis met een grafietvoering, verwarmd door een elektronenstraal gegenereerd vanuit een weerstandverwarmde wolfraamspoel. Een effusieve bundel wordt gevormd via een 1 mm opening.

Om nauwkeurige controle te garanderen, wordt de depositiesnelheid actief gestabiliseerd met een feedbacklus gebaseerd op een ionenstroom die wordt gegenereerd door een fractie van de effusieve bundel te ioniseren. Dit signaal wordt gekalibreerd tegen een kwartskristalmicrobalans (QCM). De auteurs merken op dat hoewel de QCM-aflezing ongeveer 40% hoger is dan de werkelijke snelheid door stralingsverwarming, het lineaire verband tussen ionenstroom en depositiesnelheid toelaat om gewenste snelheden snel in te stellen. Het monster wordt gedurende het hele proces op cryogene temperaturen (~100 K) gehouden om devitrificatie te voorkomen.

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten
Het artikel biedt een gedetailleerde karakterisering van het instrument via twee primaire demonstraties:

1. Bepaling van de Minimale Membraandikte: De auteurs gebruikten het instrument om siliciumdioxide ($SiO_2$)-membranen op cryo-EM-monsters af te zetten om ultradunne vloeistofcellen te creëren. Ze onderzochten de minimale dikte die nodig is voor deze membranen om het flits-smelt- en revitrificatieproces te doorstaan zonder te falen.

   • Membranen van ongeveer 0,75 nm (ongeveer 2 monolagen) slagen erin het monster af te dichten, verdamping te voorkomen en een uniforme dunne vloeistoffilm te handhaven na een 30 µs laserpuls.
   • Membranen gereduceerd tot ~0,5 nm (minder dan 2 monolagen) faalden, waarbij contrastvariaties werden vertoond die wijzen op verdamping van het monster door poriën.
   • Dit stelt vast dat de minimale functionele dikte voor het afdichten van membranen in deze geometrie net iets meer dan twee monolagen bedraagt.

2. Microseconde Mengexperimenten: De auteurs toonden de haalbaarheid aan van het opwekken van eiwitdynamiek door reagentia op het monster af te zetten.

   • Een cryo-EM-monster dat de calcium-sensitieve kleurstof Fura Red bevatte, werd voorbereid.
   • Een laag van 0,5 nm watervrij calciumchloride ($CaCl_2$) werd via verdamping op één zijde van het monster afgezet.
   • Bij flits-smelten met een 50 µs laserpuls mengden de calciumionen zich met het monster.
   • Fluorescentiemicroscopie bevestigde dat de fluorescentie-intensiteit van Fura Red afnam in het gerevitrificeerde gebied, wat wijst op de binding van calciumionen aan de kleurstof. Controle-experimenten zonder afgezet $CaCl_2$ toonden geen dergelijke contrastverandering.

Betekenis en Beweringen
De auteurs beweren dat dit instrument de basis vormt voor een geïntegreerd platform voor microseconde tijdopgeloste cryo-EM. Door fysische vapor deposition van verbindingen op bevroren monsters mogelijk te maken, stelt het systeem het volgende in staat:

• Het creëren van ultradunne vloeistofcellen die dunne films stabiliseren en het waarnemingsvenster uitbreiden van tientallen naar honderden microseconden.
• Een nieuwe strategie voor het opwekken van eiwitdynamiek waarbij reagentia (zoals kleine moleculen of liganden) worden afgezet en snel worden gemengd met het monster bij flits-smelten, waarbij de noodzaak van fotogekooide verbindingen wordt omzeild.
• De potentie voor toekomstige integratie met soft-landing massaspectrometrie-aanpakken om grotere, niet-vluchtige biomoleculen zoals peptiden of eiwitten af te zetten.

Het artikel concludeert dat deze geïntegreerde aanpak monstervervuiling reduceert door overdrachten te minimaliseren en complexe experimentele sequenties mogelijk maakt die afwisselen tussen depositie en laser-revitrificatie, waardoor het bereik van toegankelijke eiwitdynamiek wordt verbreed.