Label-free quantitative imaging of two-dimensional concentration gradients using Fabry-Pérot interferometry

Deze paper introduceert RIO, een label-vrije interferometrische methode die een Fabry-Pérot-chip gebruikt om kwantitatieve, tweedimensionale concentratiegradiënten in microfluidische systemen met hoge precisie in beeld te brengen zonder moleculaire labeling.

De kern

De "Refractieve Index Observer" (RIO): Een Magische Bril voor Onzichtbare Stromen

Stel je voor dat je naar een glazen bak met water kijkt waarin je zout oplost. Voor het blote oog is het water nog steeds helder en ondoorzichtig. Je kunt niet zien waar het zout zit en waar het water, noch hoe het zout zich langzaam door het water verspreidt. Het is alsof je probeert wind te zien door te kijken naar een rustig meer; je weet dat er beweging is, maar je kunt het niet zien.

Tot nu toe moesten wetenschappers om dit te zien, het water "verf" toevoegen (kleurstoffen of fluorescerende stoffen). Maar dat is als het met een marker op een schilderij tekenen: het verandert het schilderij zelf en kan de natuur van de verf beschadigen.

In dit paper presenteren de onderzoekers een nieuwe, slimme manier om deze onzichtbare stromen te zien zonder iets toe te voegen. Ze noemen hun uitvinding RIO (Refractive Index Observer), ofwel de "Aandachtsgever voor Lichtbreking".

Hoe werkt het? De Analogie van de Regenboog

Stel je een heel dunne, transparante kamer voor, gemaakt van twee glazen wanden die slechts een haar breed van elkaar verwijderd zijn. Dit is hun microchip.

1. Het Licht als een Regendruppel: Normaal gesproken valt er wit licht (zoals regen) op deze kamer. Maar RIO gebruikt een slimme truc: het licht wordt eerst door twee draaiende filters gestuurd. Deze filters werken als een zeer nauwkeurige kleurendraaibank. Ze laten op elk moment slechts één heel specifieke kleur (golflengte) van het licht door.
2. De Spiegelende Wanden: De binnenkant van die dunne kamer is bedekt met een half-doorlatende zilverlaag. Wanneer het licht erin valt, kaatst het heen en weer tussen de wanden, net als een ping-pongbal.
3. Het Zout als een Wegversmalling: Als er nu zout in het water zit, verandert dit de "dichtheid" van het licht in het water. In de wereld van licht noemen we dit de brekingsindex. Denk aan het zout als een onzichtbare muur die de ping-pongballen (het licht) net iets anders laat stuiteren dan wanneer er alleen water is.
4. De Regenboogpatronen (FECO): Doordat het licht heen en weer kaatst, ontstaan er patronen van licht en donker, vergelijkbaar met de regenboogkleuren die je ziet in een zeepbel. Deze patronen heten "Fringes of Equal Chromatic Order" (FECO).
   • Als er veel zout is, verschuift het patroon naar de ene kant.
   • Als er weinig zout is, verschuift het naar de andere kant.

De Camera als Detective

De RIO-apparatuur scant het hele beeld, pixel voor pixel, door langzaam de kleur van het licht te veranderen (van blauw naar groen, etc.). De camera neemt duizenden foto's van dit patroon.

Voor elk klein puntje op de foto (een pixel) kijkt de computer: "Bij welke kleur licht is dit puntje het helderst?"

• Als het helderst is bij een bepaalde kleur, weet de computer precies hoeveel zout er op dat puntje zit.
• Het resultaat is een kleurencode kaart van het zout in het water, zonder dat er ook maar één druppel kleurstof is toegevoegd.

Waarom is dit zo speciaal?

1. Het is een microscoop met superkrachten: Normale microscopen zien alleen de vorm van dingen. RIO ziet de samenstelling van vloeistoffen. Het kan zelfs zien hoe zout zich verspreidt in een stroompje water, alsof je de wind ziet waaien door de beweging van gras.
2. Het is extreem gevoelig: De machine kan veranderingen detecteren die zo klein zijn dat ze 100.000 keer kleiner zijn dan wat je met een gewone bril kunt zien. Het is alsof je het verschil kunt horen tussen een fluistering en een zucht, terwijl je in een drukke fabriek staat.
3. Het is snel en flexibel: Je kunt het gewoon op een gewone laboratoriummicroscoop zetten. Je hoeft geen dure, speciale machine te kopen.

Wat kunnen we ermee doen?

De onderzoekers hebben getoond dat ze hiermee kunnen zien hoe zout en water zich mengen in een microscopisch kanaaltje. Maar de mogelijkheden zijn eindeloos:

• Geneeskunde: Kijken hoe medicijnen zich door cellen verspreiden zonder de cellen te beschadigen met kleurstoffen.
• Chemie: Zien hoe polymeren (zoals plastic) ontstaan in een vloeistof.
• Energie: Onderzoeken hoe batterijen werken door te kijken hoe ionen zich verplaatsen.

Kortom: RIO is als een magische bril die ons laat zien wat er gebeurt in de onzichtbare wereld van vloeistoffen. Het maakt de onzichtbare zichtbaar, zonder het beeld te vervormen, en opent de deur tot een nieuw begrip van hoe de natuur in microscopische schaal werkt.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Het kwantitatief visualiseren van concentratiegradiënten op microschaal is essentieel voor het begrijpen van fysische, chemische en biologische systemen. Echter, de meeste vloeistofsystemen vertonen een zeer zwak optisch contrast bij veranderingen in concentratie, wat directe observatie bemoeilijkt.
Bestaande methoden maken vaak gebruik van fluoroforen of kleurstoffen om het contrast te verhogen. Deze labeling heeft echter aanzienlijke nadelen:

• Het kan de fysisch-chemische eigenschappen van het opgeloste stof veranderen en de onderzochte processen verstoren.
• Niet alle verbindingen kunnen effectief worden gelabeld.
• Kleurstoffen zijn gevoelig voor fotobleking en kunnen in biologische omgevingen cytotoxisch zijn.
  Er is dus een dringende behoefte aan label-vrije methoden die concentratiegradiënten kunnen meten zonder de integriteit van het systeem te compromitteren.

Methodologie: RIO (Refractive Index Observer)

De auteurs presenteren RIO, een label-vrij interferometrisch instrument dat gebaseerd is op Fabry-P´erot interferometrie binnen een microfluïdische chip.

1. Opzet:

   • Een standaard optische microscoop (omgekeerd) wordt gecombineerd met een custom-made Fabry-P´erot microfluïdische chip.
   • De chip bestaat uit twee borosilicaatglasplaten met semi-reflecterende zilverlagen (50 nm) aan de binnenkant, gescheiden door een SU8-spacer van 20 µm.
   • Het systeem werkt als een optische resonator waarbij de transmissie afhangt van de lokale brekingsindex ($n$), de afstand tussen de spiegels ($d$) en de golflengte ($\lambda$), beschreven door de Airy-functie.

2. Werking:

   • Golflengte-selectie: Wit licht passeert door twee dichroïde filters die op hoge precisie stappenmotoren zijn gemonteerd. Door de hoek van de filters te veranderen, wordt de doorgelaten golflengte fijnafgestemd (tuningsbereik ca. 508–532 nm).
   • Data-acquisitie: Voor elke meetronde wordt een volledige golflengte-scan uitgevoerd. Een CMOS-camera neemt beelden op bij elke golflengte, wat resulteert in een stapel van ongeveer 400 beelden per meting.
   • Analyse: Bij elke pixel wordt het intensiteitsspectrum geanalyseerd om de pieken van de Fringes of Equal Chromatic Order (FECO) te identificeren. Een verschuiving in de piekgolflengte ($\lambda_{F}$) correleert direct met een verandering in de brekingsindex.

3. Meetstrategie:

   • De auteurs kiezen voor een relatieve meetmethode (het volgen van de verschuiving van één specifieke FECO-piek ten opzichte van een referentietoestand) in plaats van een absolute methode.
   • Dit maximaliseert de precisie omdat de golflengte-resolutie het hoogst is bij normale invallende straling (rond 532 nm), waar de relatie tussen hoek en golflengte het meest lineair is.

Belangrijkste Bijdragen

• 2D Kwantitatieve Imaging: In tegenstelling tot eerdere werken (zoals Vogus et al., 2015) die slechts 1D lijnscans maakten, biedt RIO volledige tweedimensionale ruimtelijke kaarten van concentratiegradiënten.
• Hoge Sensitiviteit: Het systeem bereikt een precisie in de orde van grootte van $1 \cdot 10^{-5}$ brekingsindex-eenheden (RIU) per pixel. Dit is vergelijkbaar met de resolutie van conventionele bulk-refractometers, maar dan met ruimtelijke resolutie.
• Toegankelijkheid: Het instrument kan worden gemonteerd op een standaard microscoop en vereist geen dure, gespecialiseerde apparatuur of complexe data-analysepiplijnen.
• Label-vrij: Het elimineert de noodzaak voor chemische labels, waardoor het toepasbaar is op een breder scala aan systemen, inclusief die waar labeling onmogelijk of ongewenst is.

Resultaten

1. Validatie en Resolutie:

   • De brekingsindex werd gemeten voor NaCl-oplossingen (1–100 mM). De resultaten kwamen nauwkeurig overeen met referentiewaarden uit de CRC Handbook of Chemistry and Physics.
   • De ruimtelijke resolutie is onafhankelijk van de vergroting (getest met 4x, 10x en 20x objectieven), hoewel de temporele resolutie afneemt bij hogere vergrotingen door langere blootstellingstijden (8s tot 24s per scan).
   • Thermische effecten door verlichting bleken verwaarloosbaar, hoewel temperatuurschommelingen in de omgeving wel gecorrigeerd moeten worden voor de hoogste precisie.

2. Diffusiemetingen (Co-laminar Flow):

   • De auteurs toonden diffusie van NaCl in gedemineraliseerd water aan in een Y-vormig kanaal.
   • Ze vergeleken twee benaderingen voor het bepalen van de diffusiecoëfficiënt ($D$):
     • Lokaal (1D): Analyseren van lijnscans op specifieke posities.
     • Globaal (2D): Fitten van het volledige 2D-profiel met een analytisch advektie-diffusiemodel.
   • Conclusie: De 2D-benadering leverde een aanzienlijk hogere precisie op ($10^{-11} m^2/s$ onzekerheid) vergeleken met de 1D-methode ($10^{-10} m^2/s$ onzekerheid). De 2D-methode maakt beter gebruik van de beschikbare data en vermindert de impact van lokale kanaal-onregelmatigheden.

Betekenis en Toekomstperspectief

RIO opent nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van niet-evenwichtsverschijnselen op microschaal zonder de systemen te verstoren. Toepassingsgebieden omvatten:

• Polymerisatiekinetiek en enzymatische reacties.
• Cel-signalering en communicatie.
• Elektrochemische processen en batterijtechnologie.
• Actieve materialen en zachte materie.

Beperkingen en Verbeteringsmogelijkheden:

• De temporele resolutie is momenteel beperkt tot enkele seconden per beeld door de noodzaak van golflengte-scans. Dit kan worden verbeterd door de transmissie van de chip te verhogen (minder absorptie) of het aantal golflengtestappen te verminderen.
• Verdere verbetering van de brekingsindex-resolutie is mogelijk door precisie-motoren met kleinere stapgrootte of gesloten-lus hoekgevers te gebruiken.

Kortom, RIO biedt een krachtig, toegankelijk en label-vrij platform voor kwantitatieve studies van concentratievelden, wat een belangrijke stap voorwaarts is in de microfluïdische karakterisering en fundamentele wetenschap.