Traction Force Microscopy with DNA FluoroCubes

Deze studie introduceert fluorescente DNA-nanostructuren (FluoroCubes) als superieure fiduciale markers voor tractiokrachtmicroscopie, waarmee een reproduceerbare methode met hoge ruimtelijke resolutie wordt geboden voor het in kaart brengen van krachten aan het cel-substraat-interface.

De kern

Stel je voor dat cellen in ons lichaam niet alleen leven, maar ook duwen en trekken. Of het nu gaat om het genezen van een wond, het vormen van een nieuw orgaan of het bestrijden van een infectie: cellen gebruiken kracht om hun omgeving te veranderen. Wetenschappers willen graag weten hoe hard en in welke richting deze cellen duwen.

Voorheen gebruikten onderzoekers hiervoor een slimme truc: ze legden de cellen op een zacht, rubberachtig tapijt (een gel) waar kleine, fellichtende pareltjes in waren verwerkt. Als de cel duwde, verplaatsten de pareltjes zich. Door te kijken hoe ver de pareltjes bewogen, konden de wetenschappers de kracht van de cel berekenen.

Maar er was een probleem: die pareltjes zijn nogal groot (zoals kleine balletjes) en soms worden ze zelfs "opgegeten" door de cel. Hierdoor was het lastig om heel precies te zien wat er op microscopisch niveau gebeurt.

De nieuwe uitvinding: DNA-blokjes

In dit artikel beschrijven onderzoekers een revolutionaire nieuwe methode. In plaats van zware pareltjes, gebruiken ze nu DNA-blokjes (ze noemen ze "FluoroCubes").

Hier is hoe het werkt, vertaald naar alledaagse termen:

1. De DNA-blokjes zijn als mini-balletjes:
   Stel je voor dat de oude pareltjes zware bowlingballen zijn. De nieuwe DNA-blokjes zijn zo klein als een stofje, ongeveer 6 nanometer groot (dat is 10.000 keer kleiner dan een mensenhaar). Ze zijn gemaakt van DNA, het bouwplan van het leven, en zijn zo ontworpen dat ze perfect op het rubberen tapijt blijven plakken. Ze worden niet opgegeten door de cel en blijven precies waar ze moeten zijn.

2. Het rubberen tapijt (PDMS):
   De cellen zitten op een heel dun laagje siliconenrubber. Omdat de DNA-blokjes zo klein zijn, kunnen ze heel dicht op elkaar worden geplaatst, net als een dichte rij struisvogelveren. Hoe dichter ze op elkaar staan, hoe scherper het beeld wordt van de krachten die de cel uitoefent.

3. De camera en het licht:
   Om deze mini-blokjes te zien, gebruiken de onderzoekers een speciale camera die alleen het licht vangt dat heel dicht bij het oppervlak is (een techniek genaamd TIRF). Het is alsof je in een donkere kamer alleen de stofdeeltjes ziet die in een straal van een zaklamp zweven, en niet de rest van de kamer. Dit zorgt voor een kristalhelder beeld zonder ruis.

4. De slimme software (De "Twee-oog" methode):
   Omdat de DNA-blokjes zo klein zijn, zijn ze soms wat minder fel dan de grote pareltjes. Om dit op te lossen, hebben de onderzoekers een slimme computerprogramma geschreven.

   • De oude methode: Kijkt naar één beeld en probeert de beweging te raden.
   • De nieuwe methode: Kijkt naar twee beelden tegelijk. Ze gebruiken zowel de oude grote pareltjes (als referentie) als de nieuwe DNA-blokjes. De software combineert deze twee informatiebronnen, net als een mens die met twee ogen dieper kan zien dan met één oog. Hierdoor kunnen ze zelfs de kleinste bewegingen van de cel meten, met een precisie die voorheen onmogelijk was.

Waarom is dit belangrijk?

• Geen verstoring: Omdat de DNA-blokjes zo klein zijn, verstoren ze de cel niet. Het is alsof je een zware steen (de oude parel) verwijdert en vervangt door een veertje. De cel kan zich natuurlijk gedragen.
• Niet opgegeten: De cel "slurpt" de DNA-blokjes niet op, dus het beeld blijft de hele tijd helder.
• Toekomstvisie: Dit is de eerste stap naar een wereld waar we niet alleen kunnen meten hoe hard een cel duwt, maar ook wat die cel voelt. Omdat het DNA-blokjes zijn, kun je ze namelijk "programmeren" om ook andere dingen te meten, zoals de zuurgraad of de aanwezigheid van specifieke moleculen.

Samenvattend:
De onderzoekers hebben de "pareltjes" in het rubberen tapijt vervangen door ultra-kleine, slimme DNA-blokjes en een slimme dubbel-oog software ontwikkeld. Hierdoor kunnen ze nu zien hoe cellen duwen en trekken met een precisie die eerder onmogelijk was, alsof ze van een wazige foto zijn gegaan naar een 4K-foto van de mechanica van het leven.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Traction Force Microscopy (TFM) is een gevestigde methode om de mechanische krachten te kwantificeren die cellen uitoefenen op hun omgeving. Traditionele TFM maakt gebruik van fluorescerende microsferen (balletjes) als referentiemarkers (fiducials) die in het substraat zijn ingebed of erop zijn bevestigd. Hoewel deze methode robuust is, kent ze beperkingen op het gebied van ruimtelijke resolutie:

1. Resolutielimiet: De grootte van de balletjes (vaak 40-200 nm) en hun verdeling beperken de resolutie tot enkele micrometers. Dit maakt het moeilijk om krachten op subcellulaire of moleculaire schaal (nanometers) in kaart te brengen.
2. Interferentie: Het inbedden van balletjes in hydrogels veroorzaakt lichtverstrooiing en kan de mechanische eigenschappen van het substraat verstoren.
3. Cellulaire opname: Cellen kunnen traditionele fluorescente balletjes internaliseren (opnemen), wat leidt tot verlies van markers, onbetrouwbare data en artefacten in de krachtmeting.
4. Averaging: Traditionele TFM meet krachten die gemiddeld zijn over grote groepen eiwitten, waardoor fluctuaties op het niveau van individuele adhesiemoleculen onzichtbaar blijven.

Er is behoefte aan kleinere, biocompatibele markers die stabiel aan het oppervlak blijven, geen interferentie veroorzaken en compatibel zijn met super-resolutie technieken.

Methodologie

De auteurs introduceren een nieuw platform voor TFM dat gebruikmaakt van DNA FluoroCubes als alternatieve fiducials, gecombineerd met een verbeterde beeldanalyse-algoritme.

1. DNA FluoroCubes:

   • Dit zijn DNA-origami structuren van ongeveer 6 nm groot, beladen met zes Cy5-fluoroforen.
   • Ze worden bevestigd aan polydimethylsiloxane (PDMS) substraten via een biotine-NeutrAvidin chemie.
   • Het substraat wordt ook gecoat met RGD-peptiden voor celadhesie en bevat tevens traditionele fluorescente balletjes (40 nm) voor validatie.
   • De kleine grootte en de oppervlaktebevestiging minimaliseren verstoring van het substraat en voorkomen celinternalisatie.

2. Microscopie:

   • Vanwege de kleine grootte en het lagere aantal fluoroforen per marker, is Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie essentieel. Dit verhoogt het signaal-ruisverhouding aanzienlijk ten opzichte van epifluorescentie (EPI) of confocale microscopie, omdat het alleen fluoroforen binnen ~100-200 nm van het oppervlak exciteert.
   • Er wordt gebruikgemaakt van een geoptimaliseerd imaging-buffer (met glucose-oxidase, katalase en Trolox) om fotobleking en 'blinking' van de Cy5-dyes te minimaliseren.

3. Beeldanalyse (Algoritme):

   • De auteurs hebben een aangepast Kanade-Lucas-Tomasi (KLT) optische flow-algoritme ontwikkeld.
   • In tegenstelling tot standaard KLT, die één kanaal analyseert, analyseert dit dubbel-kanaal algoritme simultaan de beelden van zowel de FluoroCubes als de traditionele balletjes.
   • Het algoritme gebruikt een weging op basis van kruiscorrelatie om coherent beweging in beide kanalen te vinden, wat leidt tot een dichter en nauwkeuriger verplaatsingsveld, zelfs bij hoge dichtheden waar de punt-spreidingsfuncties (PSF) elkaar overlappen.

4. Krachtreconstructie:

   • De verkregen verplaatsingsvelden worden omgezet naar spanningsvelden (traction forces) met behulp van Bayesian Fourier Transform Traction Cytometry (BFTTC), aangepast voor substraten met een eindige dikte (~10 µm).

Belangrijkste Bijdragen

• Introductie van DNA FluoroCubes als fiducials: Eerste toepassing van DNA-origami structuren als stabiele, niet-geïnternaliseerde markers voor TFM op zachte substraten.
• Dual-Channel KLT Algoritme: Een nieuwe computermethode die informatie uit twee spectrale kanalen combineert om de resolutie en nauwkeurigheid van verplaatsingsmetingen te verbeteren, zonder afhankelijk te zijn van super-resolutie microscopie voor de tracking zelf.
• Validatie van stabiliteit: Aantonen dat FluoroCubes niet door cellen worden opgenomen (in tegenstelling tot balletjes) en stabiel blijven op het oppervlak gedurende langdurige experimenten.
• Integratie van TIRF: Demonstratie dat TIRF essentieel is voor het detecteren van deze kleine, minder foton-rijke markers op PDMS.

Resultaten

• Beeldkwaliteit: TIRF leverde een aanzienlijk betere signaal-ruisverhouding op voor FluoroCubes vergeleken met EPI, waardoor ze detecteerbaar werden.
• Stabiliteit en Internalisatie:
  • FluoroCubes vertoonden geen internalisatie door cellen; de dichtheid bleef uniform onder en buiten de cel.
  • Traditionele balletjes toonden een duidelijke variatie in dichtheid onder cellen (door internalisatie of verplaatsing), wat leidt tot onnauwkeurige metingen.
  • De fotostabiliteit van FluoroCubes was voldoende voor langdurige time-lapse experimenten, vooral met de gebruikte imaging-buffers.
• Resolutie en Krachtmeting:
  • Het dubbel-kanaal KLT-algoritme leverde een significant scherpere en minder ruisachtige verplaatsingskaart op dan het gebruik van één kanaal of het simpelweg samenvoegen van twee onafhankelijke kanalen.
  • De gereconstrueerde traction krachten toonden een sterke ruimtelijke correlatie met de lokalisatie van focale adhesie-eiwitten (kindlin-2 en β1-integrine), wat de biologische relevantie bevestigt.
  • De methode maakt het mogelijk om krachten op schalen te meten die dichter bij de grootte van subcellulaire structuren liggen dan met traditionele TFM.

Betekenis en Toekomstperspectief

Dit werk overbrugt de kloof tussen klassieke TFM (die goede globale krachtenkaarten geeft maar lage resolutie) en moleculaire krachtsensoren (die hoge resolutie geven maar vaak op stijve substraten werken).

• Moleculaire precisie: Door de grootte van de markers te verkleinen naar nanometers (6 nm), opent dit de weg voor het meten van krachten op het niveau van individuele receptoren of kleine adhesieclusters.
• Veelzijdigheid: De modulaire aard van DNA-origami stelt onderzoekers in staat om de markers te programmeren met verschillende eigenschappen (bijv. pH-sensoren, mechanische schakelaars) of om ze te combineren met andere DNA-gebaseerde sensoren.
• Toekomst: Met verdere optimalisatie van de fluoroforen (bijv. Cy3B, Alexa Fluor 647) en DNA-bescherming tegen nucleasen, kan deze techniek leiden tot een nieuwe generatie TFM-experimenten die zowel de macroscopische celbeweging als de microscopische moleculaire mechanotransductie in één experiment kunnen vastleggen.

Kortom, de paper presenteert een robuust, hoog-resolutie platform voor mechanobiologie dat de beperkingen van traditionele fluorescente balletjes overwint door gebruik te maken van DNA-nanotechnologie en geavanceerde beeldverwerking.