Positive Selection Screen Identifies Natural Product β-Catenin Inactivators

Deze studie toont aan dat een positieve selectiescreening van natuurlijke producten een effectieve strategie is om onontwikkelbare doelwitten zoals β-catenine te inactiveren, door een specifiek natuurlijk product te identificeren dat oncogene β-catenine inactivatie induceert via de activering van niet-klassieke proteïnekinase C's.

De kern

De Grote Opdracht: Een onzichtbare vijand vinden

Stel je voor dat in het lichaam van een patiënt met kanker een slechte "hoofdcommandant" aan het werk is. Deze commandant heet β-catenine (of kortweg β-cat). Normaal gesproken regelt deze commandant de groei van cellen, maar in veel kankers (zoals darm- of leverkanker) is hij kapotgegaan. Hij blijft continu "groei!" roepen, waardoor de kankercellen zich onbeperkt vermenigvuldigen.

Het probleem? Deze commandant is onvindbaar voor medicijnen. Hij heeft geen "deurtje" of "slot" waar een normaal medicijn op past. Wetenschappers noemen dit een "undruggable target" (een doelwit dat niet te genezen is).

Het Nieuwe Plan: De "Up"-Test

In plaats van te proberen de commandant te doden (wat moeilijk is), bedachten de onderzoekers een slimme truc. Ze bouwden een sluipschutters-systeem in de cellen.

1. De Val: Ze koppelten de slechte commandant (β-cat) aan een "bom" (een enzym genaamd DCK*).
2. De Munitie: Ze gaven de cellen een speciaal gif (BVdU).
3. De Regel:
   • Als de commandant (β-cat) aanwezig is, activeert hij de bom. De bom verandert het gif in een dodelijk gif. De cel sterft.
   • Als de commandant verdwijnt of uitgeschakeld wordt, gaat de bom niet af. Het gif blijft onschadelijk. De cel overleeft.

Dit is een "positieve selectie": ze zoeken niet naar cellen die sterven, maar naar de zeldzame cellen die overleven. Als een cel overleeft, betekent dit dat er iets in de cel is gebeurd dat de slechte commandant heeft uitgeschakeld.

De Schatzoeker: Duizenden Natuurlijke Mengsels

De onderzoekers wilden weten of er een natuurlijk middel bestaat dat deze commandant kan uitschakelen. Ze keken niet naar synthetische chemische stoffen (die vaak te simpel zijn), maar naar natuurlijke producten: extracten van planten, schimmels en zeedieren.

• De Bibliotheek: Ze hadden een enorme bibliotheek van 326.000 verschillende mengsels.
• De Uitdaging: Natuurlijke mengsels zijn vaak rommelig. Ze bevatten duizenden stoffen door elkaar, inclusief giftige stoffen die de test kunnen verstoren.
• De Oplossing: Ze gebruikten een soort "zeef" (fractionering). Ze splitsten elk mengsel in verschillende onderdelen. Zo hoopten ze de echte "held" te vinden tussen de ruis.

De Grote Doorbraak: Een Verborgen Kracht

Na het testen van honderdduizenden monsters vonden ze iets verrassends. De meeste "winnaars" (de cellen die overleefden) deden dit omdat ze de commandant volledig vernietigden. Maar een specifieke groep deed het anders:

Ze maakten de commandant niet kapot, maar verhuisden hem.

Stel je voor dat de commandant normaal gesproken in de "commandocentrale" (de kern van de cel) zit en daar de groeibefehlen geeft. Deze specifieke natuurlijke stof (uit een plant genaamd Euphorbiaceae) deed iets magisch:

1. Het stuurde de commandant naar een opslagruimte vlak tegen de celwand aan (een vacuole).
2. Daar zat hij opgesloten en kon hij geen bevelen meer geven.
3. De cel overleefde, omdat de commandant "stil" was, ook al was hij er nog steeds.

De Identiteit van de Held: Compound 2

De onderzoekers isoleerden de specifieke stof die dit deed. Ze noemden hem Compound 2 (een type lathyrane, een natuurlijke stof).

• Het Geheim: Het bleek dat deze stof een sleutel was voor een ander systeem in de cel: de PKC-enzymen.
• De Analogie: PKC's zijn als de "schakelaars" in de cel. Er zijn oude schakelaars (klassieke PKC's) en nieuwe schakelaars (nieuwe PKC's).
  • Andere bekende stoffen (zoals PMA) drukken op alle schakelaars. Dat is te heftig en giftig voor de cel.
  • Compound 2 is slim: het drukt alleen op de nieuwe schakelaars.
• Het Effect: Door alleen de nieuwe schakelaars in te schakelen, krijgt de commandant (β-cat) een seintje om zich te verplaatsen naar die opslagruimte. Hij wordt "inactief" gemaakt zonder gedood te worden.

Waarom is dit belangrijk?

1. Een nieuwe weg: Het bewijst dat je "onmogelijke" doelen zoals β-cat toch kunt uitschakelen, niet door ze te vernietigen, maar door ze op een slimme manier te verplaatsen.
2. Natuur is slim: Synthetische chemie heeft vaak moeite om zulke complexe vormen te maken. De natuur (de plant waar deze stof vandaan kwam) had dit al in zijn voorraadkast.
3. Toekomst: Hoewel deze stof nog niet perfect is (er moet nog meer werk aan gedaan worden), opent het een nieuwe deur voor medicijnen tegen kanker. Het laat zien dat als je kijkt naar de juiste plek (natuurlijke producten) en de juiste test (de "overlevingstest"), je verrassende oplossingen kunt vinden.

Kort samengevat:
De onderzoekers vonden een natuurlijke stof die een onbedwingbare kanker-commandant niet doodt, maar hem in een "opsluitcel" stopt door een specifieke schakelaar in de cel om te zetten. Dit is een grote stap in de strijd tegen kanker die tot nu toe als ongeneeslijk werd beschouwd.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Veel genetisch gevalideerde doelen in kanker, waaronder de transcriptiefactor $\beta$-catenin ($\beta$-cat), worden historisch gezien als "undruggable" (niet aan te pakken met medicijnen) omdat ze gebrek hebben aan geschikte hydrofobe zakken voor kleine moleculen. Hoewel er recente vooruitgang is geboekt met K-Ras-inhibitoren, blijft het remmen van $\beta$-cat, dat geactiveerd wordt door mutaties in genen zoals APC, AXIN of CTNNB1 (voorkomend in darm-, maag-, lever- en baarmoederkanker), een grote uitdaging. Bestaande inhibitoren die de binding aan TCF4 blokkeren of degradatie induceren, zijn vaak niet robuust. Er is behoefte aan nieuwe mechanismen om oncogene $\beta$-cat te inactiveren.

Methodologie

De auteurs ontwikkelden en gebruikten een celgebaseerde fenotypische "up-assay" (positieve selectie) om natuurlijke producten te screenen die $\beta$-cat inactiveren, in plaats van alleen te zoeken naar afbraak (degradatie).

1. Reporter-systeem: Ze gebruikten 293FT-cellen (die onafhankelijk zijn van $\beta$-cat) die een bicistronische reporter tot expressie brachten:
   • Een fusie-eiwit van een oncogene variant van $\beta$-cat (S37C) en een gemodificeerde deoxycytidinekinase (DCK*).
   • Groen fluorescerend eiwit (GFP).
   • De DCK* enzyme converteert de niet-natuurlijke nucleoside BVdU in een toxine.
2. Selectieprincipe:
   • Cellen met hoge niveaus van het $\beta$-cat-DCK*-fusie-eiwit sterven in aanwezigheid van BVdU.
   • Als een verbinding de abundantie van het fusie-eiwit verlaagt (degradatie) OF het eiwit inactief maakt (zodat het BVdU niet kan omzetten), overleven de cellen en behouden ze GFP-expressie.
   • Om achtergrondsterfte te minimaliseren, werd het gen TK1 (thymidinekinase 1) uitgeschakeld via CRISPR/Cas9, omdat TK1 de toxiciteit van BVdU kan moduleren.
3. Screening:
   • Er werd gescreend op 326.304 monsters, bestaande uit 40.744 ruwe extracten en 285.560 gefractioneerde delen van natuurlijke producten (van de NCI Natural Product Discovery bibliotheek).
   • Het gebruik van gefractioneerde mengsels (F1-F7) hielp om toxische verbindingen te scheiden en de actieve componenten te concentreren.
4. Validatie en Isolatie:
   • Positieve hits werden gehertest en gecontra-gescreend tegen andere DCK*-fusies (bijv. DCK*-IKZF1) om specificiteit te bepalen.
   • Actieve subfracties werden gezuiverd via HPLC en geanalyseerd met NMR en massaspectrometrie om de actieve verbindingen te identificeren.
   • Mechanistische studies omvatten western blots, immunofluorescentie, RNA-sequencing (RNAseq), microscopische thermoforese (MST) voor bindingsaffiniteit, en moleculaire modellering.

Belangrijkste Resultaten

1. Identificatie van Hits:

   • Van de 326.304 monsters werden 353 subfracties (uit 162 unieke lineages) geïdentificeerd die de overleving van $\beta$-cat-DCK* cellen bevorderden zonder de overleving van cellen met alleen DCK* te beïnvloeden.
   • De hits vertegenwoordigden diverse bronnen (voornamelijk landplanten en mariene bronnen).

2. Twee Mechanismen van Inactivatie:

   • Downregulators: Sommige fracties verlaagden de abundantie van $\beta$-cat (degradatie). Eén bekende neolignan werd geïsoleerd, maar was instabiel en moeilijk te bestuderen.
   • Inactivators (De kernvondst): Een opvallende groep fracties verhoogde juist de abundantie van het $\beta$-cat-DCK*-fusie-eiwit (en GFP), maar maakte het toch functioneel inactief. Dit suggereerde dat het eiwit wel aanwezig was, maar niet in staat was om BVdU te converteren.

3. Identificatie van Compound 2 (Lathyranol):

   • Uit de "inactivator" lijn L90865 werden twee lathyrane-achtige natuurlijke producten geïsoleerd: Compound 2 (lathyranol, met een vrij primair alcohol op C19) en Compound 3 (lathyranol-19-acetaat, geacetyleerd).
   • Alleen Compound 2 was actief. Het verlaagde de expressie van $\beta$-cat doelen (Axin2, LEF1, LGR5) en induceerde JunB.
   • Compound 2 veroorzaakte een herlokalisatie van $\beta$-cat naar grote, vacuole-achtige structuren nabij het celmembraan, waardoor het eiwit functioneel inactief werd.

4. Mechanisme: Selectieve Activering van "Novel" PKC:

   • De auteurs ontdekten dat Compound 2 werkt door Proteïne Kinase C (PKC) te activeren.
   • Specificiteit: Compound 2 activeert specifiek de nieuwe (novel) PKC's (zoals PKC$\delta$ en PKC$\theta$), maar niet de klassieke PKC's (zoals PKC$\alpha$). Dit werd bevestigd door:
     • Het gebruik van specifieke inhibitoren (Bis-I blokkeerde het effect, Go6976 niet).
     • CRISPR-knockout van klassieke PKC's had geen invloed, terwijl constitutief actieve nieuwe PKC's het fenotype nabootsten.
     • Directe bindingsstudies (MST) toonden aan dat Compound 2 een 20-voudig hogere affiniteit heeft voor PKC$\delta$ dan voor PKC$\alpha$.
   • Structuur-Activiteit: Het vrije primair alcohol op C19 is cruciaal voor de binding en activiteit. Het geacetyleerde analogon (Compound 3) bindt niet en is inactief.
   • Moleculaire Modellering: Simulaties voorspellen dat het alcohol-groepje van Compound 2 een stabiel waterstofbruggennetwerk vormt in de C1b-domein van PKC$\delta$, vergelijkbaar met bekende agonisten, wat leidt tot de actieve "up"-configuratie.

5. Vergelijking met Bestaande Agonisten:

   • Bekende PKC-agonisten zoals PMA en Ingenol-3-angelate (ING) activeerden zowel klassieke als nieuwe PKC's en waren te giftig voor deze positieve selectie-assay.
   • Compound 2 biedt een betere therapeutische venster omdat het selectief nieuwe PKC's activeert.

Bijdragen en Significantie

• Nieuwe Strategie voor "Undruggable" Doelen: Het artikel demonstreert dat het inactiveren van een onmogelijk te blokkeren eiwit (door het te verplaatsen naar een inactieve subcellulaire locatie via een signaalweg) een geldige therapeutische strategie is, zelfs zonder degradatie.
• Kracht van Fenotypische Screening: Het succes van de "up-assay" benadrukt de waarde van celgebaseerde fenotypische screens boven puur target-gebaseerde benaderingen, vooral voor het vinden van nieuwe biologische mechanismen (zoals PKC-afhankelijke herlokalisatie).
• Herwaardering van Natuurlijke Producten: De studie toont aan dat gefractioneerde natuurlijke productbibliotheken, ondanks de complexiteit, rijke bronnen zijn van unieke, drug-achtige moleculen met hoge selectiviteit die moeilijk te synthetiseren zijn.
• PKC als Tumoronderdrukker: De bevindingen ondersteunen het groeiende idee dat PKC-agonisten (specifiek voor nieuwe PKC's) tumoronderdrukkende eigenschappen kunnen hebben, in tegenstelling tot het historische beeld van PKC als oncoogeen.
• Toekomstperspectief: Compound 2 dient als een krachtig startpunt voor de ontwikkeling van nieuwe kankertherapieën die gericht zijn op het inactiveren van oncogene $\beta$-cat via de PKC-pad, en biedt een blauwdruk voor het screenen van andere "undruggable" doelen.