Oligo DNA-based quantum dot (QD) single-particle tracking for multicolor single-molecule imaging

In deze studie wordt een nieuwe methode voor multicolor single-particle tracking met quantum dots gepresenteerd, die gebruikmaakt van specifieke DNA-hybridisatie om verschillende membraanmoleculen, zoals lipiden en receptoren, gelijktijdig in levende cellen te labelen en hun diffusiedynamiek te analyseren.

De kern

Titel: Hoe wetenschappers een DNA-telefoonnummer gebruiken om moleculen te volgen

Stel je voor dat je een enorme, drukke stad hebt: de cel. In deze stad rennen er miljoenen kleine voertuigen rond, zoals lipiden (vetjes) en eiwitten. Wetenschappers willen graag weten hoe deze voertuigen zich bewegen: rennen ze snel, blijven ze steken in file, of wisselen ze van baan?

Om dit te zien, gebruiken ze een speciale camera en heel kleine, fellichtende bolletjes genaamd Quantum Dots (QD's). Deze bolletjes zijn als superhelden-lantaarnpalen: ze zijn extreem helder, gaan lang mee en kunnen in verschillende kleuren licht schijnen. Als je ze aan een voertuig plakt, kun je het perfect volgen.

Het probleem: De sleutel die niet past
Tot nu toe was er een groot probleem. Om die lantaarnpaal (de Quantum Dot) aan een voertuig te plakken, moesten wetenschappers een heel specifieke "sleutel" gebruiken, zoals een antilichaam. Het probleem? Er zijn maar heel weinig soorten sleutels. Als je twee verschillende voertuigen tegelijk wilt volgen (bijvoorbeeld een rood busje en een blauwe auto), heb je twee verschillende sleutels nodig. Maar vaak passen die sleutels niet goed bij elkaar of werken ze niet tegelijk. Het is alsof je probeert twee verschillende auto's te parkeren met dezelfde sleutel, maar de sloten zijn te klein.

De oplossing: Een DNA-telefoonnummer
In dit onderzoek hebben de wetenschappers een slimme nieuwe uitvinding bedacht: DNA als lijm.

In plaats van een sleutel gebruiken ze een stukje DNA. DNA werkt als een telefoonnummer: als je een nummer hebt dat precies het tegenovergestelde is van een ander nummer, passen ze perfect bij elkaar (zoals A met T, en C met G).

1. Het label: Ze plakken een klein stukje DNA (een "telefoonnummer") op het voertuig (bijvoorbeeld een lipide of een eiwit) in de cel.
2. De lantaarn: Ze plakken een ander stukje DNA (het "tegenovergestelde nummer") op de Quantum Dot.
3. De koppeling: Als je ze bij elkaar brengt, zoeken ze elkaar op en klikken ze vast, net als een slot en sleutel die perfect passen.

Waarom is dit zo cool?
Stel je voor dat je een heel groot telefoonboek hebt. Je kunt voor elk voertuig in de stad een uniek telefoonnummer bedenken.

• Wil je een rood busje volgen? Geef het nummer "010-AAAAA".
• Wil je een blauwe auto volgen? Geef het nummer "010-BBBBB".
• Wil je een groene fiets volgen? Geef het nummer "010-CCCCC".

Omdat DNA zo specifiek is, zoeken alleen de Quantum Dots met het juiste nummer hun weg naar het juiste voertuig. Ze verwarren elkaar niet. Dit betekent dat je meerdere soorten voertuigen tegelijk kunt volgen in dezelfde cel, elk met een andere kleur lantaarn, zonder dat ze in de war raken.

Wat hebben ze ontdekt?
De onderzoekers hebben dit getest op twee dingen:

1. Vetjes (Lipiden): Ze hebben gezien dat deze snel rondrennen, maar soms vastlopen in de "verkeersdrukte" van de cel.
2. Ontvangstapparatuur (Receptoren): Ze hebben ook de GABA-receptoren (belangrijk voor rust in de hersenen) gevolgd. Deze bewegen langzamer.

Het mooie is: deze nieuwe methode werkt net zo goed als de oude, moeilijke methoden, maar is veel flexibeler. Ze konden zelfs zien dat de vetjes en de receptoren zich anders gedroegen, terwijl ze allebei tegelijk in dezelfde cel werden gevolgd.

De conclusie
Dit onderzoek is als het vinden van een universele sleutelkast. Door DNA te gebruiken als een soort "telefoonnummer-systeem", kunnen wetenschappers nu veel meer dingen tegelijk in de levende cel bekijken. Het maakt het mogelijk om complexe verkeerssituaties in onze cellen te bestuderen, wat helpt om te begrijpen hoe onze hersenen werken en hoe ziektes ontstaan.

Kortom: Ze hebben de sleutel gevonden om de dansvloer van de cel in kleurrijke, simultane beweging te zien.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Quantum dot single-particle tracking (QD-SPT) is een krachtige techniek om de dynamiek van membraanmoleculen (zoals lipiden en eiwitten) in levende cellen te bestuderen. Kwikpunten (QDs) bieden uitstekende eigenschappen voor multicolor imaging, zoals een breed excitatiespectrum en een smalle emissiebandbreedte. Echter, de toepassing van multicolor QD-SPT (het gelijktijdig volgen van meerdere verschillende moleculen) in levende cellen is beperkt door de gebrek aan specifieke conjugatiemethoden.

De huidige standaardmethoden (zoals primaire antilichamen gekoppeld aan secundaire antilichamen of biotine-avidine interacties) bieden slechts een beperkt aantal specifieke combinaties. Dit maakt het moeilijk om meerdere verschillende doelwitmoleculen tegelijkertijd te labelen met QDs van verschillende golflengten zonder kruisreactiviteit of complexe stapsgewijze protocollen. Er is behoefte aan een nieuwe strategie die gebaseerd is op een veelvoud aan specifieke interacties om multicolor imaging mogelijk te maken.

Methodologie

De auteurs hebben een nieuwe labelingstrategie ontwikkeld die gebruikmaakt van hybridisatie van complementaire enkelstrengs DNA (ssDNA) als linkermolecuul tussen de QD en het doelwitmolecuul.

1. DNA-conjugatie:

   • Lipiden: Het fosfolipide DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine) werd gekoppeld aan een 20-mer ssDNA (polyA of willekeurige sequenties) via een thiol-maleimide reactie of copper-free click chemistry.
   • Eiwitten: Een antilichaam gericht tegen de GABA-A receptor (GABAAR) werd gekoppeld aan een polyA-ssDNA sequentie.
   • QDs: Quantum dots (QD605 en QD655) werden geconjugateerd met een complementaire ssDNA-sequentie (bijv. polyT of het complement van de willekeurige sequentie) via een streptavidine-biotine binding.

2. Labelingsprotocol:

   • Primaire hippocampale neuronen van ratten werden geïncubeerd met het ssDNA-gelabelde lipide of antilichaam.
   • Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met de ssDNA-gelabelde QDs.
   • De specifieke binding berust op de hybridisatie tussen de complementaire DNA-sequenties op het membraanmolecuul en de QD.

3. Experimentele opzet:

   • Single-particle tracking (SPT): Gebruikmakend van TIRF-microscopie (Total Internal Reflection Fluorescence) en EM-CCD camera's bij 37°C.
   • Validatie: Vergelijking met conventionele QD-labeling (via Fab-fragmenten) en met organische kleurstoffen (ATTO647-DPPE) voor diffusiecoëfficiënten.
   • Multicolor Imaging: Gelijktijdige labeling van DPPE (met QD655) en GABAAR (met QD605) in dezelfde cel.
   • Functionele tests: Ca2+-imaging om te verifiëren dat de labeling de functie van de GABAAR niet beïnvloedt.

Belangrijkste Bijdragen

• DNA-gemedieerde specificiteit: Demonstratie dat DNA-hybridisatie een stabiele en specifieke link vormt voor QD-labeling in levende cellen, waarbij de specificiteit wordt bepaald door de DNA-sequentie.
• Vergelijking van sequenties: Onderzoek naar het effect van verschillende DNA-sequenties (polyA/polyT versus willekeurige sequenties) op de labelings-efficiëntie en de diffusiedynamiek.
• Multicolor SPT: De eerste succesvolle toepassing van multicolor QD-SPT in levende neuronen om twee verschillende membraanmoleculen (een lipide en een receptor) gelijktijdig en onderscheidend te volgen.
• Validatie van functionaliteit: Aantonen dat de labeling de fysiologische functie van de GABA-receptor niet verstoort.

Resultaten

1. Specificiteit en Stabiliteit:

   • QDs met een complementaire DNA-sequentie (bijv. polyT-QD op polyA-DPPE) bleven specifiek gebonden aan het celoppervlak.
   • QDs met niet-complementaire sequenties (bijv. polyA-QD op polyA-DPPE) of willekeurige sequenties toonden geen significante binding.
   • Behandeling met DNase leidde tot een snelle afname van het aantal gebonden QDs, wat bevestigt dat de binding DNA-afhankelijk is.

2. Invloed van DNA-sequentie op labelings-efficiëntie:

   • De polyA/polyT-combinatie resulteerde in een ongeveer 10-voudig hogere labelingsdichtheid dan willekeurige sequenties, ondanks dat de smelttemperatuur ($T_m$) van polyA/polyT lager is.
   • Dit wordt toegeschreven aan de hoge mate van vrijheid in sequentie-overlap bij polyA/polyT en de vorming van secundaire structuren bij willekeurige sequenties die de hybridisatie kunnen belemmeren.
   • Cruciaal: De diffusiecoëfficiënt ($D$) van de gelabelde moleculen werd niet beïnvloed door het type DNA-sequentie.

3. Diffusiedynamiek:

   • De diffusie van DPPE gemeten met DNA-QD-SPT kwam overeen met metingen met organische kleurstoffen (ATTO647), maar toonde een hogere fractie van immobiele deeltjes aan de onderkant van de cel (naast het dekglas) vanwege sterische hindering door de grotere QD.
   • De diffusiecoëfficiënt van GABAAR gemeten met DNA-QD-SPT was vergelijkbaar met die gemeten met conventionele Fab-fragment labeling, hoewel er een lichte verschuiving was in de verdeling van de $D$-waarden.

4. Multicolor Imaging:

   • Er werd succesvol gelijktijdig gelabeld met QD605 (voor GABAAR) en QD655 (voor DPPE) in dezelfde cel.
   • Er was geen signaal-kruispraat (cross-talk) tussen de kanalen.
   • De diffusie-eigenschappen van beide moleculen bleven onveranderd ten opzichte van enkelkleurige experimenten.
   • De resultaten toonden duidelijk verschillende diffusiecoëfficiënten aan: DPPE (lipide) diffundeerde sneller dan GABAAR (eiwit).

5. Functionele Integriteit:

   • Ca2+-imaging toonde aan dat GABAAR's gelabeld met DNA-QD's nog steeds correct reageerden op muscimol (agonist) en KCl-stimulatie, wat aantoont dat de labeling de receptorfunctie niet beïnvloedt.

Significantie

Deze studie biedt een doorbraak in de single-molecule imaging van levende cellen. De ontwikkelde oligo DNA-gebaseerde QD-labeling lost het probleem van beperkte multicolor opties op door gebruik te maken van de enorme diversiteit aan DNA-sequenties.

• Toekomstperspectief: Deze methode maakt het mogelijk om in de toekomst meer dan twee kleuren tegelijkertijd te gebruiken (multicolor QD-SPT), wat essentieel is voor het bestuderen van complexe interacties tussen verschillende membraanmoleculen in hun native omgeving.
• Technische vooruitgang: Het biedt een robuust alternatief voor traditionele antilichaam-gebaseerde methoden, met name voor het gelijktijdig volgen van lipiden en eiwitten zonder complexe stapsgewijze blokkering.
• Toepassing: De techniek is direct toepasbaar in neurobiologisch onderzoek om de organisatie van membraandomeinen, synaptische transmissie en signaaltransductie op nanometerschaal te ontrafelen.

Samenvattend introduceert dit artikel een veelzijdig, specifiek en stabiel platform voor multicolor single-particle tracking, wat de weg vrijmaakt voor geavanceerde studies van membraandynamiek in levende systemen.