Two-photon characterisation of long-Stokes-shift dye ATTO 490LS for single-laser multicolour imaging

Dit artikel beschrijft de karakterisering van de twee-foton eigenschappen van de lang-Stokes-verschuivende kleurstof ATTO 490LS en demonstreert succesvol meerkleurige beeldvorming in Drosophila-hersenen met een enkele laser.

De kern

Titel: Hoe je met één laser twee verschillende kleuren kunt zien in een vliegenhersenen

Stel je voor dat je een heel klein, ingewikkeld stadje wilt verkennen: de hersenen van een fruitvlieg. Om dit stadje te zien, gebruiken wetenschappers een speciale soort "flitslicht" (een laser) dat door het weefsel heen kan kijken zonder het te beschadigen. Dit heet twee-fotonen microscopie.

Maar er is een probleem: de meeste van deze flitslichten kunnen maar één kleur licht uitstralen. Als je twee verschillende dingen in het stadje wilt zien (bijvoorbeeld de wegen en de huizen), heb je normaal gesproken twee verschillende flitslichten nodig. Dat is duur en ingewikkeld.

De onderzoekers in dit paper hebben een slimme oplossing gevonden met een speciaal soort fluorescerende verf genaamd ATTO 490LS. Hier is hoe het werkt, vertaald naar alledaagse termen:

1. De "Magische Verfkoker" (De Lange Stokes-verschuiving)

Normaal gesproken werkt verf zo: je schijnt blauw licht op een object, en het reflecteert weer blauw licht. Dat is saai en moeilijk om te onderscheiden van het oorspronkelijke licht.

Deze nieuwe verf, ATTO 490LS, is echter een magische koker.

• Je schijnt er een rood-oranje licht op (de laser).
• De verf "sluikt" dit licht op en verliest een hoop energie (alsof het een zware rugzak afzet).
• Vervolgens geeft het een heel diep rood licht terug.

Het verschil tussen het licht dat erin gaat en het licht dat eruit komt, is enorm groot. In de vakwereld noemen ze dit een "lange Stokes-verschuiving". In het Nederlands kunnen we het zien als een kleurveranderende tovertruc: je gooit een oranje bal naar binnen, en er komt een felrode bal uit. Omdat de kleuren zo verschillend zijn, kan de camera ze heel makkelijk van elkaar scheiden, zelfs als ze door hetzelfde flitslicht worden aangezet.

2. De "Twee-in-één" Camera-truc

De onderzoekers wilden weten of ze deze verf konden gebruiken met een standaard laser die 920 nanometer (een soort diep-oranje licht) uitzendt. Dit is een veelgebruikte laser in laboratoria, maar niemand wist of deze verf daarop reageerde.

Ze deden een proef:

• Ze namen een fruitvlieghersenen en lieten de cellen een "vlaggetje" dragen (een eiwit).
• Ze lieten de verf aan deze vlaggetjes plakken.
• Ze schenen de 920 nm-laser erop.

Het resultaat? De verf sprong direct aan! Hij gaf een helder rood licht af. Dit was een verrassing, want tot nu toe wisten we niet of deze verf werkte met twee-fotonen lasers.

3. Het "Dubbel-Detectie" Avontuur

Nu kwam het echte toverwerk. De onderzoekers wilden twee dingen tegelijk zien:

1. De wegen: Ze gebruikten een andere, bekende verf (Alexa Fluor 488) die groen licht geeft.
2. De huizen: Ze gebruikten de nieuwe ATTO 490LS die rood licht geeft.

Ze zetten allebei de verfen aan met één enkele laser (de 920 nm laser).

• De groene verf (Alexa) gaf groen licht.
• De rode verf (ATTO) gaf rood licht.

Omdat de rode verf zo'n grote "kleurverandering" maakt (van oranje laser naar dieprood licht), verwarden de camera's de kleuren niet. Ze konden perfect zien:

• Waar alleen de wegen waren (alleen groen).
• Waar alleen de huizen waren (alleen rood).
• Waar ze elkaar kruisten (groen én rood, wat paars maakt).

Waarom is dit belangrijk?

Voorheen hadden onderzoekers twee dure lasers nodig om twee kleuren tegelijk te bekijken. Nu kunnen ze met één laser en twee camera's (één voor groen, één voor rood) een heel gedetailleerd plaatje maken van wat er in een levende hersenstructuur gebeurt.

Het is alsof je eerder twee verschillende sleutels nodig had om twee deuren te openen, maar nu blijkt dat één enkele sleutel beide deuren kan openen, zolang je maar de juiste handgreep (de filter) gebruikt.

Kortom: De onderzoekers hebben bewezen dat je met een bestaande, goedkope laser en een slimme nieuwe verf twee verschillende dingen tegelijk kunt zien in een levend organisme. Dit opent de deur voor veel goedkopere en betere experimenten om te begrijpen hoe onze hersenen werken.

Technische samenvatting

Titel: Twee-foton karakterisering van de lang-Stokes-shift kleurstof ATTO 490LS voor meerkleurige imaging met één enkele laser

1. Het Probleem

In de twee-foton (2P) microscopie is het vaak nodig om meerdere fluorescente markers tegelijkertijd te detecteren (multiplexing) om complexe biologische structuren of processen te bestuderen. Een beperking van veel bestaande microscopen, vooral die met oudere of "legacy" apparatuur, is dat ze slechts één vaste excitatie-laserbron hebben (vaak ingesteld op 920 nm voor het exciteren van groene fluorescente eiwitten zoals GCaMP).
Traditionele kleurstoffen hebben vaak een korte Stokes-shift (het verschil tussen excitatie- en emissiegolflengte is klein), wat leidt tot overlap tussen excitatie- en emissiespectra. Dit veroorzaakt achtergrondruis en maakt het moeilijk om groene en rode signalen tegelijkertijd te scheiden met één enkele laser. Er was behoefte aan een kleurstof met een lange Stokes-shift (LSS) die efficiënt kan worden geëxciteerd door een 920 nm laser, maar een emissie heeft die ver genoeg verschoven is om eenvoudig te worden gescheiden van groene signalen, zonder dat er een tweede laser nodig is. De optische eigenschappen van de veelbelovende kleurstof ATTO 490LS voor twee-foton imaging waren tot nu toe niet gekarakteriseerd.

2. Methodologie

De auteurs voerden een uitgebreide spectrale karakterisering en imaging-experimenten uit op ex vivo hersenen van de fruitvlieg (Drosophila melanogaster):

• Proefobject: Gebruik van elav-Gal4>UAS-TID-Dlg1 vliegen. Hiermee werd TurboID-Dlg1 (een biotinylatie-enzym) tot expressie gebracht in neuronen. Na voeding met biotine werden nabijgelegen eiwitten biotinylated.
• Kleuring:
  • ATTO 490LS: Een streptavidine-geconjugateerde ATTO 490LS-kleurstof werd gebruikt om de biotinylated eiwitten te labelen (via BioID-proximaliteit).
  • Alexa Fluor 488: Een anti-c-Myc antilichaam gekoppeld aan Alexa Fluor 488 werd gebruikt om TurboID-Dlg1 direct te labelen als groen referentiepunt.
• Spectrale Scans:
  • Excitatie-scan: De emissie-intensiteit werd gemeten terwijl de excitatiegolflengte werd variëerd van 680 nm tot 1200 nm.
  • Emissie-scan: De emissiespectrum werd gemeten bij vaste excitatiegolflengtes (780 nm, 920 nm, 940 nm, 1040 nm).
  • Apparatuur: Een Leica TCS SP8 DIVE multiphoton microscoop met een instelbare laser voor de scans.
• Twee-foton Imaging:
  • Beeldvorming uitgevoerd op Thorlabs microscopen (A-SCOPE en B-SCOPE) met een vaste 920 nm fiber laser.
  • Detectie via twee fotomultiplicatoren (PMT's): een groen-gefilterde (500–550 nm) voor Alexa Fluor 488 en een rood-gefilterde (570–640 nm) voor ATTO 490LS.
  • Vergelijking van signalen bij verschillende laservermogens en detectorversterkingen.

3. Belangrijkste Bijdragen

• Eerste karakterisering: Dit is het eerste rapport dat de twee-foton eigenschappen van ATTO 490LS in detail beschrijft.
• Validatie van 920 nm excitatie: Het bewijs dat ATTO 490LS effectief kan worden geëxciteerd door een standaard 920 nm laser, een golflengte die normaal wordt gebruikt voor groene fluoroforen (zoals GFP/GCaMP).
• Demonstratie van duplex imaging: Het succesvol tonen van gelijktijdige imaging van een rode (ATTO 490LS) en een groene (Alexa Fluor 488) marker met één enkele laserbron en twee detectoren, zonder spectrale overlap die de signalen verstoort.

4. Resultaten

• Excitatie-spectrum: ATTO 490LS vertoont twee-foton excitatie pieken bij 780 nm, 940 nm en 1040 nm. Hoewel 780 nm de hoogste intensiteit geeft, is 940 nm (en bijbehorend 920 nm) zeer effectief en ideaal voor compatibiliteit met standaard 920 nm lasers.
• Emissie-spectrum: Bij excitatie met 920 nm, 940 nm of 1040 nm piekt de emissie van ATTO 490LS rond 640 nm. Dit is een zeer lange Stokes-shift vergeleken met de excitatie.
• Autofluorescentie: Excitatie bij 920 nm resulteert in aanzienlijk minder autofluorescentie van het weefsel vergeleken met kortere golflengtes (zoals 780 nm), wat de signaal-ruisverhouding verbetert.
• Duplex Imaging:
  • De auteurs slaagden erin om structuren zoals de ellipsoid body (alleen rood gelabeld), de γ-lobes van de mushroom body (alleen groen gelabeld) en de α- en β-lobes (dubbel gelabeld) duidelijk te onderscheiden.
  • Er was geen significante kruisverontreiniging (crosstalk) tussen de kanalen; het groene signaal bleef schoon in het groene kanaal en het rode signaal in het rode kanaal.
  • De techniek werkte zowel bij lage (30 mW) als hogere (80 mW) laservermogens.

5. Betekenis en Toekomstperspectief

• Verlaagde technische drempel: Deze bevindingen maken het mogelijk voor laboratoria met oudere microscopen (met slechts één 920 nm laser) om meerkleurige twee-foton experimenten uit te voeren. Er is geen dure upgrade naar een tunabele laser of een tweede laser nodig.
• Integratie met functionele imaging: ATTO 490LS kan worden gebruikt als een structurele marker (rood) naast functionele groene indicatoren (zoals GCaMP voor calciumtransiënten). Dit stelt onderzoekers in staat om neurale circuits te bestuderen waarbij zowel de anatomie als de activiteit tegelijkertijd wordt vastgelegd in levende dieren.
• Toekomstige toepassingen: De auteurs plannen om ATTO 490LS te conjugeren met liganden voor HaloTag, SNAP-tag en andere tags, wat chemogenetische labeling in transgene vlieglijnen mogelijk maakt. Dit breidt de toolkit uit voor geavanceerde gedrags- en circuitstudies.

Kortom, dit werk positioneert ATTO 490LS als een krachtig nieuwe hulpmiddel voor meerkleurige twee-foton microscopie, vooral in systemen met beperkte laserbronnen, en opent nieuwe wegen voor de integratie van structurele en functionele neurale imaging.