Selective suppression and biasing of chemokine receptors CCR9 and ACKR4 through targeting CCL25 with de novo miniproteins

Dit onderzoek toont aan dat *de novo* ontworpen miniproteïnes, ontwikkeld met het BindCraft-platform, de chemokine CCL25 op twee manieren kunnen moduleren: door CCR9- en ACKR4-gemedieerde migratie te blokkeren of door via een bias-mechanisme selectief G-eiwit-signaling te bevorderen en arrestine-recruitment te remmen.

De kern

Titel: Hoe we met 'mini-schermen' de verkeersregelaars van ons immuunsysteem hebben gekraakt

Stel je voor dat je immuunsysteem een enorme, drukke stad is. In deze stad zijn er speciale boodschappers (chemokines) die rondlopen met een briefje. Ze roepen: "Hier is gevaar! Kom snel naar de stadswallen!" of "Hier is rust, blijf hier!".

Deze boodschappers hebben een specifieke slot (de receptor) op de deuren van de cellen. Als de boodschapper het slot opent, gaan de cellen in beweging. Dit is heel handig als je een wond moet helen, maar als het verkeerd gaat, raken de cellen in paniek en veroorzaken ze ontstekingen (zoals bij darmziekten) of helpen ze kanker zich te verspreiden.

Het probleem? De "deuren" (receptoren) zijn zo ingewikkeld dat artsen er tot nu toe geen goede medicijnen voor hebben kunnen vinden. Ze proberen de sloten te blokkeren, maar dat werkt niet goed.

De slimme oplossing: Een nieuwe aanpak
In plaats van te proberen de deur te blokkeren, hebben deze onderzoekers een heel slim idee bedacht: blokkeer de boodschapper zelf.

Ze hebben met de hulp van supermoderne kunstmatige intelligentie (AI) nieuwe, kleine eiwitten ontworpen. Noem ze mini-schermen. Deze mini-schermen zijn zo gemaakt dat ze perfect om de boodschapper (CCL25) heen passen, net als een hand die een briefje vastpakt voordat hij het aan de deur kan geven.

Wat hebben ze ontdekt?
Ze hebben vier verschillende soorten mini-schermen gemaakt, en ze werken op twee heel interessante manieren:

1. De "Stille" Blokkade (De meeste schermen):
   Drie van de mini-schermen (VUP25101, VUP25107, VUP25112) pakken de boodschapper zo stevig vast dat hij helemaal niet meer bij de deur kan komen. Het is alsof je de boodschapper in een betonnen blok giet.

   • Resultaat: Geen boodschap = geen actie. De cellen blijven stil. Dit is perfect om ontstekingen te stoppen.

2. De "Truc" (Het speciale scherm VUP25111):
   Dit is het meest fascinerende deel. Dit ene mini-scherm pakt de boodschapper vast op een heel andere plek. Het laat de boodschapper nog wel bij de deur komen, maar het verandert de manier waarop hij de deur opent.

   • Het effect: De boodschapper opent de deur nog steeds, maar alleen voor de "snelweg" (G-eiwitten) die de cellen laat bewegen. De "alarmbel" (arrestine) die de cellen zou laten stoppen of zich laten opruimen, gaat niet af.
   • Waarom is dit cool? Het is alsof je een auto hebt die alleen maar vooruit kan rijden, maar niet kan remmen of achteruit. In dit geval zorgt het ervoor dat de boodschapper wel werkt voor één type cel (CCR9), maar niet voor een ander type (ACKR4). Het is een heel precieze manier om het immuunsysteem te sturen zonder alles plat te leggen.

Waarom is dit belangrijk?
Tot nu toe was het heel moeilijk om medicijnen te maken die specifiek op deze boodschappers werken. Dit onderzoek laat zien dat we met AI nieuwe, kleine eiwitten kunnen "hallucineren" (ontwerpen) die precies doen wat we willen.

• Voor de patiënt: Dit opent de deur voor nieuwe behandelingen tegen darmontstekingen (zoals de ziekte van Crohn) en misschien zelfs tegen kanker die zich via het darmkanaal verspreidt.
• Voor de wetenschap: Het bewijst dat je niet altijd de deur (receptor) hoeft te blokkeren. Soms is het slimmer om de boodschapper (chemokine) te vangen en te manipuleren.

Kortom:
De onderzoekers hebben met AI een setje mini-schermen ontworpen die de boodschappers van ons immuunsysteem vangen. Sommige schermen gooien de boodschapper gewoon weg (geen actie), en één speciaal scherm laat de boodschapper nog wel werken, maar dan op een heel specifieke manier. Dit is een enorme stap vooruit in het begrijpen en genezen van complexe ziektes.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Chemokines en hun receptoren (GPCR's) spelen een cruciale rol bij het reguleren van immuunresponsen en celmigratie. Dysregulatie van dit systeem, specifiek de interactie tussen de chemokine CCL25 en zijn receptoren CCR9 (een canonieke receptor) en ACKR4 (een atypische "scavenger"-receptor), is geassocieerd met inflammatoire darmziektes (zoals de ziekte van Crohn) en kankermetastase naar de darmen.
Hoewel therapeutische modulatie van dit systeem wenselijk is, heeft de ontwikkeling van effectieve medicijnen gericht op de receptoren (CCR9-antagonisten) tot nu toe gefaald in klinische trials. Natuurlijke regulatiemechanismen richten zich vaak op de chemokine zelf (bijvoorbeeld door pathogenen die evasines produceren), maar het ontwikkelen van specifieke modulators die op de kleine chemokine-proteïnen richten, is technisch uitdagend vanwege de lage "ligandability" voor kleine moleculen.

Methodologie

De auteurs hebben een de novo eiwitontwerp-benadering gebruikt om nieuwe binders te genereren die specifiek op CCL25 richten, in plaats van op de receptoren.

1. Computational Design (BindCraft):

   • Er werd gebruikgemaakt van het BindCraft-platform, een AI-gedreven workflow gebaseerd op AlphaFold2-Multimer.
   • Het doel was het genereren van de novo miniproteïnen (75-125 aminozuren) die CCL25 binden.
   • Om de focus te leggen op de kern van de chemokine en de interactie met de receptoren te blokkeren, werd een getrainde versie van CCL25 gebruikt (CCL25_ΔCT, residuen 1-77) voor het ontwerp, hoewel de binders later getest werden op het volledige eiwit.
   • Er werden geen vooraf gedefinieerde "hotspots" opgelegd, waardoor het algoritme de hele oppervlakte van CCL25 kon verkennen.
   • Van de gegenereerde ontwerpen werden de top-kandidaten gefilterd op basis van ipTM-scores (interface predicted TM-score), structuurdiversiteit en stabiliteit (via MD-simulaties).

2. Experimentele Validatie:

   • Vier geselecteerde miniproteïnen (VUP25101, VUP25107, VUP25111, VUP25112) werden geproduceerd in E. coli en gezuiverd.
   • Binding: Bindingsaffiniteit werd gemeten met Fluorescentie Polarization (FP).
   • Receptorbinding: De invloed op de binding van CCL25 aan CCR9 en ACKR4 werd getest met TR-FRET.
   • Signaaltransductie: Verschillende downstream effecten werden gemeten met BRET-assays:
     • Recrutering van β-arrestin2.
     • Recrutering van mini-Gi-eiwitten (G-proteïne koppeling).
     • cAMP-productie (via CAMYEL biosensor).
     • Recrutering van GRK3 (GPCR-kinase).
     • Receptorinternalisatie.
   • Fysiologische Respons: Migratie van MOLT-4 lymfoblasten (die CCR9 tot expressie brengen) werd gemeten in een transwell-chemotaxis-assay.

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

1. Succesvolle Generatie van Binders
Het ontwerp leverde miniproteïnen op met hoge affiniteit voor CCL25 (pKd-waarden rond 6.3 - 6.8). De binders bleken specifiek te zijn voor CCL25 en hadden geen effect op andere chemokine-receptorparen (zoals CXCL12/CXCR4).

2. Twee Distincte Mechanismen van Actie
De studie onthulde twee verschillende categorieën van binders met unieke functionele uitkomsten:

• Categorie A: CRS1-blokkade (VUP25101, VUP25107, VUP25112)

  • Locatie: Deze binders richten zich op de C-terminale helix van CCL25, wat de interactie met het N-terminale domein van de receptor (CRS1) blokkeert.
  • Effect: Ze blokkeren volledig de binding van CCL25 aan zowel CCR9 als ACKR4.
  • Signaal: Ze onderdrukken zowel G-proteïne-activatie als arrestin-recrutering volledig.
  • Fysiologie: Ze remmen de migratie van MOLT-4 cellen effectief.

• Categorie B: G-proteïne-biasing (VUP25111)

  • Locatie: Deze binder bindt langs de β1-streng van CCL25, een regio die de CRS1- en CRS2-interactie-oppervlakken niet volledig blokkeert.
  • Structuur: In silico-modellering suggereert dat het complex van VUP25111:CCL25 een steric clash veroorzaakt met de extracellulaire lus 2 (ECL2) van CCR9, maar niet met ACKR4 (dat een kortere lus heeft).
  • Selectiviteit: Het complex kan nog steeds binden aan CCR9 en ACKR4, maar induceert een G-proteïne-bias.
    • Het blokkeert arrestin-recrutering naar CCR9 volledig.
    • Het laat G-proteïne-activatie (Gi-koppeling en cAMP-inhibitie) intact.
    • Het remt niet de activatie van ACKR4 (in tegenstelling tot de andere binders).
  • Fysiologie: In tegenstelling tot de andere binders, remt VUP25111 de migratie van MOLT-4 cellen niet, omdat deze migratie afhankelijk is van G-proteïne-signalering.

3. Mechanistische Inzichten

• Het onderzoek toont aan dat het blokkeren van alleen de CRS1-interactie (receptor N-terminus) voldoende is om de receptoractivatie te onderdrukken.
• Het demonstreert dat het moduleren van de chemokine zelf (in plaats van de receptor) kan leiden tot signaling bias. VUP25111 verandert de natuurlijke agonist CCL25 in een G-proteïne-biased ligand voor CCR9.
• De selectiviteit voor CCR9 versus ACKR4 wordt bepaald door de lengte van de ECL2-lus, wat een nieuwe strategie biedt voor het ontwikkelen van receptor-specifieke therapeutica.

Significantie en Toekomstperspectief

• Nieuwe Therapeutische Strategie: De resultaten tonen aan dat het richten op de chemokine-ligand met de novo ontworpen miniproteïnen een krachtige alternatieve route is voor het moduleren van GPCR-signaleringspaden, waar traditionele receptor-antagonisten vaak falen.
• Tool voor Fundamenteel Onderzoek: Deze miniproteïnen fungeren als unieke moleculaire tools om de structurele basis van chemokine-receptor-activatie en bias te ontrafelen. Ze maken het mogelijk om specifieke stappen in het signaalpad (zoals arrestin vs. G-proteïne) te scheiden.
• Behandeling van Ontstekingsziektes: Door de migratie van immuuncellen naar de darmen te remmen (via CRS1-blokkade) zonder de scavenger-functie van ACKR4 te verstoren (wat zou kunnen leiden tot verhoogde serum-niveaus van CCL25), biedt dit een veiliger therapeutisch venster voor ziektes zoals de ziekte van Crohn.
• AI in Drug Discovery: Het succes van BindCraft bevestigt de potentie van AI-gedreven de novo eiwitontwerp voor het creëren van hoog-affiniteit binders tegen "on-druggable" targets zoals kleine chemokines.

Samenvattend biedt deze studie een bewezen raamwerk voor het gebruik van AI om nieuwe, selectieve en bias-inducerende therapeutische modaliteiten te ontwikkelen voor complexe immuunsignaleringspaden.