Structure, biosynthesis, and bioactivity of nostolysamides

In deze studie worden de structuur, biosynthese en bioactiviteit van de nieuwe lanthipeptiden nostolysamiden uit *Nostoc punctiforme* onthuld, waarbij wordt aangetoond dat het synthetase NpuM complexe ringstructuren vormt en dat de acylering van lysine-residuen door NpuN niet essentieel is voor de door membraanverstoring gemedieerde antimicrobiële en antifungale werking.

De kern

De Ontdekking van de "Nostolysamide": Een Microscopisch Zwaard tegen Schimmels

Stel je voor dat je een oude, vergeten schatkist vindt in de diepe zee van het DNA van een blauwgroene alge (een cyanobacterie genaamd Nostoc punctiforme). In deze schatkist ligt een geheim wapen: een klein, ingewikkeld eiwit dat de natuur heeft ontworpen om schadelijke schimmels te verslaan. Wetenschappers hebben dit wapen nu ontcijferd en het een naam gegeven: nostolysamide.

Hier is hoe dit verhaal zich afspeelt, vertaald naar alledaagse taal:

1. De Bouwtekening en de Meester-Bouwer

In de cel van de alge ligt een blauwdruk (het DNA) voor een bouwproject.

• De ruwe steen: Er is een lang, saai eiwit (de voorloper) dat nog niets bijzonders doet.
• De meester-bouwer (NpuM): Er is een speciale machine, een enzym genaamd NpuM. Deze machine is als een slimme naaimachine die de ruwe steen pakt en er een ingewikkeld patroon in naait.
• Het naaipatroon: De machine pakt bepaalde plekken in het eiwit en naait ze aan elkaar met "draadjes" van zwavel. Hierdoor ontstaan er kleine ringen in het eiwit. Denk aan een touw dat eerst slap is, maar waar de naaimachine strakke lussen in maakt. Dit maakt het eiwit stijf en sterk, zoals een goed gevlochten touw.

2. De Verrassing: Ringen die Overlappen

Meestal zijn deze ringen in dergelijke eiwitten netjes naast elkaar geplaatst. Maar bij de nostolysamide is het een beetje een knoop in het touw.

• De wetenschappers ontdekten dat er één ring losstaat aan het begin, maar dat de andere drie ringen overlappen aan het einde. Het is alsof je drie armbanden om je pols doet die door elkaar heen lopen in plaats van naast elkaar.
• Om dit precies te begrijpen, deden de onderzoekers een soort "chirurgie" op het eiwit. Ze verwijderden stukjes (mutaties) om te zien welke ringen er precies ontstonden. Het resultaat? Een complex, maar perfect gevormd 3D-gebouw dat de schimmelcel kan aanvallen.

3. Het "Vette" Geheim (De Acyl-groep)

In de blauwdruk zat ook een instructie voor een andere machine (NpuN) die een stukje vet (een vetzuur) aan het eiwit plakt.

• De verwachting: De wetenschappers dachten: "Ah, dit vetje is waarschijnlijk de sleutel! Het maakt het wapen vetter, zodat het beter door de celwanden van de schimmel kan dringen, net zoals een vetlaagje een bootje helpt drijven."
• De realiteit: Tot hun verbazing bleek dat het eiwit ook zonder dat vetje net zo goed werkte. Het vetje was dus niet nodig om de schimmel te doden. Het is alsof je een superheld een cape geeft, maar hij blijkt net zo snel te vliegen zonder. Het vetje heeft misschien een andere, nog onbekende functie, maar voor het doden van de schimmel is het niet essentieel.

4. Hoe werkt het wapen?

Dit nieuwe wapen, de nostolysamide, is een anti-schimmelmiddel.

• Het doelwit: Het valt schimmels aan zoals Candida (een veelvoorkomende schimmel die infecties veroorzaakt).
• De aanval: Het wapen gaat niet zitten om een specifiek slotje in de schimmel te openen. Nee, het doet iets veel brutaler: het pakt de celwand van de schimmel vast en maakt er gaten in.
• Het resultaat: De schimmelcel verliest zijn inhoud, net als een ballon die een prik krijgt, en sterft af. Dit werkt ook tegen bacteriën, maar het is vooral krachtig tegen schimmels.

5. Waarom is dit belangrijk?

We zitten in een wereld waar schimmels steeds resisterender worden tegen onze huidige medicijnen. Het vinden van een nieuw soort wapen dat werkt op een heel andere manier (door de celwand te doorprikken) is als het vinden van een nieuwe sleutel voor een deur die we niet meer openkonden.

Samenvattend:
De wetenschappers hebben een verborgen schat uit een alge gehaald. Ze hebben gezien hoe de natuur dit kleine, ringvormige eiwit bouwt, ontdekt dat het vetje erop niet nodig is voor de kracht, en bewezen dat het een dodelijk wapen is tegen gevaarlijke schimmels. Het is een mooi voorbeeld van hoe we door naar de natuur te kijken, nieuwe oplossingen kunnen vinden voor medische problemen.

Technische samenvatting

Probleemstelling

Invasieve schimmelinfecties, veroorzaakt door organismen zoals Candida soorten, vormen een groeiende wereldwijde bedreiging voor de volksgezondheid, met name door toenemende resistentie tegen bestaande antischimmelmiddelen. Hoewel lanthipeptiden (een klasse van ribosomaal gesynthetiseerde en post-translationeel gemodificeerde peptiden of RiPPs) bekend staan om hun antibacteriële eigenschappen, zijn er slechts zeer weinig voorbeelden van lanthipeptiden met bewezen antischimmelactiviteit. Eerdere genomische studies identificeerden een biosynthetische gencluster (BGC) in de cyanobacterie Nostoc punctiforme PCC 73102 dat codeert voor een klasse II-lanthipeptide en een GNAT-enzym (NpuN) dat lange ketens vetzuren aan de zijketen van een lysine-residu koppelt. Echter, de exacte structuur, de ringpatronen en de biologische activiteit van deze verbindingen (vernoemd nostolysamiden) waren tot nu toe niet bepaald vanwege zeer lage productieniveaus en isolatieproblemen.

Methodologie

De auteurs gebruikten een geavanceerde aanpak om deze verbindingen te karakteriseren:

1. Heterologe expressie: Ze co-expresseren het precursorpeptide NpuA (gefuseerd met een N-terminale SUMO-tag om de opbrengst en oplosbaarheid te verbeteren) met de synthetase NpuM en de acyltransferase NpuN in Escherichia coli.
2. Structuuropheldering:
   • Massaspectrometrie (MS/MS): Tandem massaspectrometrie met collision-activated dissociation (CAD) werd gebruikt om fragmentatiepatronen te analyseren en het ringpatroon te bepalen.
   • Mutagenese: Site-directed mutagenese werd toegepast om specifieke cysteïne- en serine/threonine-residuen te vervangen (bijv. C25A, S4A, C14A, C20A) om de vorming van specifieke ringen te testen en de overlappende ringstructuur te ontrafelen.
   • Marfey's analyse: Gebruikmakend van L-FDLA-derivatisatie en LC-MS werd de stereochemie van de lanthionine (Lan) en methyllanthionine (MeLan) bindingen bepaald.
   • In vitro enzymatische studies: NpuN werd gezuiverd en getest met verschillende acyl-CoA-substraten om het substraatspecificiteit en de regioselectiviteit van de acylering te bepalen.
3. Bioactiviteitstests:
   • Microbiologische assays: Agar-diffusie en broth-dilutie assays werden uitgevoerd tegen diverse Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën en schimmels (waaronder Candida albicans, C. glabrata, en C. tropicalis).
   • Werkingsmechanisme: Tests om te bepalen of het peptide bindt aan Lipid II (via de LiaRS-assay) en of het celmembraan depolariseert (via de DiSC3(5)-fluorescentie-assay).

Belangrijkste Bijdragen en Resultaten

1. Structuur en Stereochemie:

• De onderzoekers slaagden erin het lanthipeptide (nu "nostolysamide C" genoemd voor de niet-acylerde vorm) te produceren en te zuiveren.
• Ringpatroon: De analyse toonde een niet-overlappende ring aan het N-uiteinde (gevormd door Cys5 en Thr9) en drie overlappende ringen aan het C-uiteinde. Het meest waarschijnlijke patroon is:
  • Ring A: Cys5 – Thr9
  • Ring B: Cys14 – Ser18
  • Ring C: Cys20 – Ser23
  • Ring D: Cys25 – Thr12 (de grootste macrocyclus, die de andere ringen kruist).
• Stereochemie: Marfey's analyse bevestigde dat alle vier de Lan- en MeLan-residuen de DL-configuratie hebben, wat kenmerkend is voor klasse II-lanthipeptiden.
• Dehydratatie: Er vonden vier dehydratatiereacties plaats (Ser/Thr naar Dha/Dhb), waarbij Ser4 niet werd gedehydrateerd.

2. Biosynthese en Enzymologie:

• NpuM (Synthetase): Dit enzym behoort tot de ProcM-clade en katalyseert ringvorming met zowel C-naar-N als N-naar-C richting, wat leidt tot het complexe overlappende ringpatroon.
• NpuN (Acyltransferase): Dit GNAT-enzym koppelt lange ketens vetzuren (zoals hexadecenoïl en hydroxyhexadecenoïl) specifiek aan de zijketen van Lys1 in het precursorpeptide. In vitro-studies toonden aan dat NpuN een brede substraattolerantie heeft voor verschillende acyl-CoA's, maar palmitoyl-CoA (C16) de hoogste conversie oplevert.

3. Bioactiviteit:

• Antischimmelactiviteit: Nostolysamide C vertoont sterke activiteit tegen Candida soorten (MIC waarden rond 6,25 µM). Het is fungicide (doodt de schimmel) en niet alleen fungistatisch.
• Antibacteriële activiteit: Het toont ook activiteit tegen Bacillus subtilis, maar is minder actief tegen Gram-negatieve bacteriën.
• Invloed van acylering: Curieus genoeg had de toevoeging van vetzuren (acylering) door NpuN geen significante invloed op de antimicrobiële of antischimmelactiviteit. Dit suggereert dat de acylering niet strikt noodzakelijk is voor deze specifieke bioactiviteit in de geteste omstandigheden.
• Werkingsmechanisme: Het peptide bindt niet aan Lipid II (in tegenstelling tot veel andere lantibiotica zoals nisin). In plaats daarvan veroorzaakt het depolarisatie van het celmembraan van Candida tropicalis, wat leidt tot celdood. De intacte tetracyclische structuur (alle vier de ringen) is cruciaal voor de activiteit, zoals bleek uit de sterk verminderde activiteit van het C25A-mutant.

Significantie

• Nieuwe Klasse van Antischimmelmiddelen: Dit is het eerste bekende voorbeeld van een klasse II-lanthipeptide met bewezen antischimmelactiviteit. Dit breidt het spectrum van bekende lanthipeptide-activiteiten aanzienlijk uit.
• Unieke Structuur: De ontdekking van een lanthipeptide met drie overlappende ringen en een specifieke DL-stereochemie draagt bij aan het begrip van de diversiteit en evolutie van lanthipeptide-biosynthese.
• Mogelijke Toepassingen: Gezien de toenemende resistentie tegen antischimmelmiddelen, biedt nostolysamide een nieuw chemisch raamwerk voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutica. Het werkingsmechanisme via membraandepolarisatie biedt een alternatief voor bestaande middelen die vaak op celwandcomponenten (zoals Lipid II of ergosterol) richten.
• Inzicht in GNAT-functie: Hoewel acylering vaak de stabiliteit en activiteit van peptiden verhoogt, toont dit onderzoek aan dat dit niet altijd het geval is. De functie van NpuN en de acylering in de natuurlijke omgeving (waarschijnlijk gerelateerd aan de interactie met de gastheer Macrozamia of concurrentie in de bodem) blijft een onderwerp voor verder onderzoek.

Samenvattend biedt dit onderzoek een volledig karakterisering van een nieuw lanthipeptide, onthult een uniek biosynthetisch pad en identificeert een potentieel nieuwe leidverbinding voor de bestrijding van schimmelinfecties.