Characterization of nanoparticles and fluorescent recombinant extracellular vesicles with three high-sensitivity flow cytometers

Deze studie vergelijkt de prestaties van drie hooggevoelige flowcytometers (NanoFCM, BD Influx en CytoFLEX LX) bij het analyseren van nanodeeltjes en fluorescente recombinante extracellulaire vesikels, waarbij de sterke punten en beperkingen van elk platform voor kwalitatieve en kwantitatieve metingen worden in kaart gebracht.

De kern

Titel: De Grote Deeltjesschaal: Hoe Drie Microscoops de Kleinste Verpakkingen van het Leven Meten

Stel je voor dat je in een enorme, donkere zaal staat vol met miljarden piepkleine ballen. Sommige zijn zo groot als een knikker, andere zo klein als een stofje dat je met het blote oog niet eens ziet. Deze ballen zijn Exosomen (of EV's): kleine zakjes die onze cellen gebruiken om boodschappen te sturen. Ze zijn zo klein dat ze net als spookjes door de muren lijken te glippen.

Om deze spookjes te zien, hebben wetenschappers speciale "microscoops" nodig die zo gevoelig zijn dat ze zelfs het licht kunnen zien dat deze deeltjes weerkaatsen. Maar hier is het probleem: niet alle microscoops zijn even goed. Sommige zien alleen de grote ballen, andere zien ook de stofjes, en weer andere zien misschien wel te veel ruis (zoals stof in de lucht) waardoor je de echte ballen niet meer kunt vinden.

In dit onderzoek hebben drie onderzoekers drie heel verschillende, superkrachtige microscoops naast elkaar gezet om te kijken welke de beste is. Ze noemen ze:

1. De NanoFCM (NF): De nieuwe, gespecialiseerde specialist.
2. De BD Influx (IF): De ervaren, aangepaste oude garde.
3. De CytoFLEX LX (CF): De moderne, veelzijdige all-rounder.

Hier is wat ze ontdekten, vertaald in alledaagse taal:

1. Het Testen met "Standaard Ballen" (Silica-deeltjes)

Eerst testten ze de machines met een mengsel van kunstmatige silica-balletjes van verschillende maten (van 68 tot 155 nanometer). Dit is als het testen van een camera met een meetlat van bekende lengtes.

• De Specialist (NF): Deze machine was de enige die de aller-kleinste balletjes (68 nm) kon zien. Maar, als je te weinig balletjes in de machine stopte, verdwenen ze in de "ruis" (de achtergrondstoring). Het was alsof je in een stil bos probeert een muis te horen, maar de wind te hard waait.
• De Oude Garde (IF): Deze zag de iets grotere balletjes (91 nm), maar de allerkleinsten miste hij. Wel had hij een heel rustige achtergrond, waardoor de signalen die hij zag, heel betrouwbaar waren.
• De All-rounder (CF): Deze zag de balletjes nauwelijks. De achtergrondruis was zo hard (zoals een drukke markt), dat de echte balletjes erin verdwenen.

Les: Er is geen "één machine voor alles". Je moet kiezen op basis van wat je zoekt en hoe je de machine instelt.

2. Het Gevaar van Te Dicht op Elkaar (Zwerm-gedrag)

Vervolgens keken ze naar de concentratie. Wat gebeurt er als je te veel balletjes tegelijk in de machine gooit?

• Bij de Specialist (NF): Hij kon heel veel balletjes aan zonder dat ze in de war raakten. Hij hield ze allemaal apart.
• Bij de Oude Garde en de All-rounder (IF & CF): Als je te veel balletjes tegelijk stopte, gingen ze "zwermen". Ze botsten tegen elkaar en de machine dacht dat het één groot monster was, in plaats van duizenden kleine balletjes. Het was alsof je te veel mensen in een kleine lift probeert te persen; ze raken in de war en je kunt niemand meer tellen.

Les: Je moet de juiste hoeveelheid deeltjes kiezen. Te weinig = ze verdwijnen in de ruis. Te veel = ze raken in de war en je telt ze verkeerd.

3. De Magische Flitsers (Fluorescerende Deeltjes)

Om het echt goed te doen, gebruikten ze speciale "flitsende" deeltjes (rEV's). Deze deeltjes hebben een klein lampje in zich (een groen lampje).

• Zonder lampjes (alleen lichtweerkaatsing): De machines hadden moeite om de deeltjes te vinden tussen alle andere rommel in de vloeistof. Het was alsof je probeert een witte auto te vinden in een sneeuwstorm.
• Met lampjes (fluorescentie): Zodra ze op de "groene lampjes" gingen letten, werd het veel makkelijker! De machines konden de echte deeltjes direct zien en de rest negeren.
  • De Specialist (NF) en de Oude Garde (IF) deden dit heel goed.
  • De All-rounder (CF) had nog steeds wat moeite, maar met de lampjes werd het resultaat veel beter.

Les: Als je de deeltjes kunt "verlichten" (met een lampje of kleurtje), is het veel makkelijker om ze te vinden en te tellen, zelfs op de mindere machines.

Conclusie: Wat moeten we onthouden?

Dit onderzoek is als een test voor drie verschillende auto's op een racecircuit.

• De nieuwe specialist is razendsnel en ziet alles, maar hij is gevoelig voor de weersomstandigheden (concentratie).
• De oude garde is betrouwbaar en stabiel, maar hij mist de aller-kleinste obstakels.
• De moderne all-rounder is veelzijdig, maar heeft soms last van "verkeersdrukte" als er te veel deeltjes zijn.

De belangrijkste boodschap voor de toekomst:
Als artsen en wetenschappers in de toekomst deze kleine deeltjes willen gebruiken om ziektes zoals kanker te diagnosticeren, moeten ze heel voorzichtig zijn met hoe ze meten. Ze moeten:

1. De juiste machine kiezen voor hun specifieke vraag.
2. De concentratie van het monster perfect afstemmen (niet te dik, niet te dun).
3. Zoveel mogelijk gebruikmaken van "flitsende" markers, zodat ze zeker weten dat ze de juiste deeltjes tellen en niet per ongeluk ruis.

Kortom: Het is een stap in de goede richting om deze microscopische wereld beter te begrijpen, maar er is nog veel werk aan de winkel om alle machines op één lijn te krijgen.

Technische samenvatting

Titel: Karakterisering van nanopartikels en fluorescerende recombinante extracellulaire vesikels met drie hooggevoelige flowcytometers.

1. Het Probleem
Hoewel flowcytometrie (FC) een krachtige techniek is geworden voor de analyse van nanopartikels (NPs) en extracellulaire vesikels (EVs), blijft de detectie van individuele deeltjes in de submicron-grootte (zoals EVs) uitdagend. De signalen van deze deeltjes liggen vaak dicht bij of onder de detectielimiet (LOD) van het instrument.

• Heterogeniteit: EVs variëren sterk in grootte en concentratie.
• Instrumentgeneraties: Er zijn verschillende generaties FC-instrumenten beschikbaar, variërend van aangepaste eerste generatie tot gespecialiseerde derde generatie (nFCM), maar er ontbreekt een gestandaardiseerde vergelijking van hun prestaties onder gecontroleerde omstandigheden.
• Referentiematerialen: Traditionele polystyreen (PS) deeltjes hebben een hogere brekingsindex dan biologische EVs, waardoor ze meer licht verstrooien en instrumenten "te goed" presterend laten lijken voor echte EV-analyse. Er is behoefte aan materialen met een lagere brekingsindex (zoals silica) en biologische referentiematerialen om instrumenten eerlijk te valideren.

2. Methodologie
De auteurs voerden een vergelijkende studie uit met identieke monsters, gemeten tegelijkertijd op drie verschillende hooggevoelige flowcytometers in dezelfde locatie:

• Instrumenten:
  1. NanoFCM (NF): Een derde generatie, volledig op nanopartikels toegespitst instrument (nFCM) met een 532 nm laser en enkel-foton telling (SPCM).
  2. BD Influx (IF): Een aangepaste eerste generatie instrument (jet-in-air) met hoge gevoeligheid en een 488 nm laser.
  3. CytoFLEX LX (CF): Een tweede generatie cuvette-based instrument met meerdere lasers (waaronder 405 nm violet).
• Referentiematerialen:
  • Silica Nanopartikels (SiNPs): Een mengsel van niet-fluorescerende deeltjes (68, 91, 114 en 155 nm) met een lage brekingsindex, vergelijkbaar met EVs.
  • Polystyreen (PS) NPs: Voor vergelijking (hoge brekingsindex).
  • Recombinante EVs (rEVs): Commercieel verkrijgbare, fluorescerende (GFP-expressie) biologische referentiematerialen (gemiddelde diameter ~125 nm).
• Aanpak:
  • Analyse van SiNPs over een concentratiebereik (10⁶ tot 10⁹ deeltjes/mL) om de gevoeligheid voor lichtverstrooiing (SSC, FSC, VSSC) te testen.
  • Analyse van rEVs met verschillende strategieën: lichtverstrooiing-drempelwaarde (SSCt), combinatie van verstrooiing en fluorescentie-gating, en puur fluorescentie-drempelwaarde (FLt).
  • Systematische verdunningen om het effect van "swarm detection" (coïncidentie) en achtergrondruis te evalueren.

3. Belangrijkste Bijdragen

• Cross-platform validatie: Eerste directe vergelijking van drie instrumentgeneraties met identieke monsters en operators.
• Gebruik van SiNPs: Demonstratie dat silica-deeltjes essentieel zijn voor het valideren van instrumenten voor lage-brekingsindex deeltjes (zoals EVs), in tegenstelling tot de gebruikelijke PS-deeltjes.
• Optimalisatie van detectiestrategieën: Identificatie van de beste drempelwaarde-strategie per instrument (NF gebruikt SSC, IF gebruikt FSC, CF gebruikt VSSC) en het belang van fluorescentie-gating voor kwantificatie.
• Concentratie-afhankelijkheid: Kwantificering van de impact van sampleconcentratie op de betrouwbaarheid van de meting (swarm effect vs. achtergrondruis).

4. Resultaten

• Lichtverstrooiing (SiNPs):
  • De NanoFCM was het enige instrument dat de kleinste populatie (68 nm) kon detecteren, maar alleen bij hoge concentraties. Bij lage concentraties overlapte het signaal met de achtergrondruis.
  • De BD Influx en CytoFLEX LX konden de 91 nm populatie detecteren, maar faalden bij de 68 nm populatie met standaard SSC-instellingen.
  • De CytoFLEX LX had de hoogste achtergrondruis, wat de detectie van kleine deeltjes sterk belemmerde.
  • Polystyreen deeltjes (hoge brekingsindex) waren op alle drie de instrumenten makkelijker te detecteren dan silica deeltjes, wat de noodzaak van silica als referentie bevestigt.
• Fluorescerende rEVs:
  • Kwantificering: Meting alleen op basis van lichtverstrooiing (SSCt) leidde tot grote variaties in de geschatte concentratie tussen de instrumenten en vaak tot over- of onderschatting.
  • Fluorescentie-gating: Het gebruik van fluorescentie (GFP) als drempelwaarde of gating-criterium verbeterde de specificiteit aanzienlijk en verlaagde de achtergrondruis.
  • Instrumentprestaties:
    • NF: Vereiste hogere concentraties om achtergrondruis te overwinnen, maar leed bij te hoge concentraties niet aan swarm-detectie door de zeer lage doorstroom.
    • IF en CF: Werkten goed bij lagere concentraties, maar vertoonden bij hoge concentraties duidelijke "swarm detection" (coïncidentie), wat leidde tot onbetrouwbare kwantificering.
  • Conclusie: De meest betrouwbare kwantificering werd bereikt met de CytoFLEX LX en BD Influx bij gebruik van puur fluorescentie-drempelwaarden (FLt) op de meest verdunde monsters, en met de NanoFCM bij gebruik van verstrooiing gecombineerd met fluorescentie-gating (SSCt+FLg).

5. Betekenis en Conclusie
De studie benadrukt dat er geen "one-size-fits-all" strategie bestaat voor flowcytometrie van EVs. De keuze van het instrument en de meetstrategie hangt af van de sampleconcentratie, de grootte van de deeltjes en de specifieke hardware van het apparaat.

• Aanbevelingen: Voor betrouwbare kwantificering is het cruciaal om de sampleconcentratie per instrument te optimaliseren om zowel swarm-detectie als achtergrondruis te minimaliseren.
• Referentiematerialen: Goed gekarakteriseerde fluorescerende rEVs en silica-deeltjes zijn onmisbaar als referentiematerialen om instrumenten te valideren en cross-platform studies mogelijk te maken.
• Toekomst: De resultaten onderstrepen de noodzaak van gestandaardiseerde kalibratiemethoden die compatibel zijn met zowel oude als nieuwe generatie instrumenten om de translatie van EV-biomarkers naar de kliniek te versnellen.