Characterizing MINFLUX imaging performance with DNA origami

Dit artikel beschrijft hoe DNA-origami met herhalende dockingstrengen wordt gebruikt om drift te corrigeren en de precisie van MINFLUX-beeldvorming over langdurige opnames tot ongeveer 2 nm te waarborgen, wat vervolgens wordt toegepast op het afbeelden van cardiale eiwitten in weefsel.

De kern

De Microscoop die niet kan stilstaan: Hoe DNA-origami helpt bij het scherpstellen van de toekomst

Stel je voor dat je een heel klein, glinsterend object wilt fotograferen met een camera die zo krachtig is dat je de deeltjes erop kunt tellen. Maar er is een probleem: terwijl je aan het fotograferen bent, trilt de camera een beetje, en beweegt het object ook nog eens heel langzaam. Als je dit niet corrigeert, wordt je foto wazig en onbruikbaar.

Dit is precies het probleem dat wetenschappers hebben bij een nieuwe, superkrachtige microscooptechniek genaamd MINFLUX. Deze techniek kan objecten zien die kleiner zijn dan een haar, maar alleen als je heel lang kunt fotograferen (soms wel 20 uur!). Helaas, na zo'n lange tijd, begint er een kleine "druif" (in het Engels: drift) op te treden door temperatuurveranderingen of trillingen.

In dit artikel laten de onderzoekers zien hoe ze dit probleem oplossen met een slimme truc: DNA-origami.

1. Het probleem: De "druif" van de microscoop

MINFLUX is als een super-scherpe flitslamp die in het donker zoekt naar een muis. Om de muis precies te vinden, schijnt de lamp in een patroon. Maar als je urenlang fotografeert, schuift de hele kamer (de microscoop) een beetje op.

• Vergelijking: Het is alsof je probeert een foto te maken van een muntje op de grond, maar je staat op een schommelende boot. Zelfs als je heel stil probeert te staan, beweegt de boot een beetje. Je foto wordt dan een wazige vlek in plaats van een scherp muntje.

2. De oplossing: DNA als een "Anker"

De onderzoekers gebruiken DNA-origami. Dit zijn kleine, platte structuren die ze zelf hebben gevouwen uit DNA (het bouwstof van het leven). Ze zien eruit als kleine, platte bakplaten met daarop precies geplaatste "haakjes" (de ankers).

• De truc: Ze plakken deze DNA-structuren op het monster dat ze willen bekijken. Omdat ze precies weten waar deze haakjes zitten (ze hebben ze zelf gemaakt), kunnen ze gebruiken als een referentiepunt. Als de foto wazig wordt, weten ze: "Ah, de hele foto is verschoven, want dit haakje hoort hier te zijn."

3. Het probleem met de haakjes: Ze vallen eraf

Een eerdere versie van deze techniek had een nadeel: de haakjes vielen soms af na een paar uur.

• Vergelijking: Stel je voor dat je probeert een muur te bouwen, maar de bakstenen (de haakjes) lossen na een uur op. Dan kun je de muur niet meer afmaken.
• De nieuwe oplossing: De onderzoekers hebben nu "herhalende haakjes" gebruikt. In plaats van één haakje, hebben ze een lange streng DNA gemaakt met 10 haakjes achter elkaar.
• Analogie: Het is alsof je niet één touwtje gebruikt om een boot vast te maken, maar een heel dik anker met 10 touwen. Als één touw breekt, houden de andere 9 het vast. Hierdoor kunnen ze urenlang blijven fotograferen zonder dat de ankers verdwijnen.

4. De slimme berekening: Het "Zwerm-algoritme"

Nu hebben ze deze DNA-structuren, maar hoe corrigeren ze de beweging?
Ze kijken naar de "zwerm" van foto's die ze van één haakje hebben gemaakt.

• De analogie: Stel je voor dat je een groep mensen ziet staan die allemaal proberen op dezelfde plek te staan. Als de grond beweegt, bewegen ze allemaal een beetje mee. Als je kijkt hoe ze ten opzichte van elkaar bewegen, kun je precies berekenen hoe de grond heeft bewogen.
• De computer kijkt naar alle foto's van één DNA-haakje. Als de foto's een beetje verspreid liggen, weet de computer: "De microscoop is verschoven." De computer berekent dan precies hoe ze de foto's terug moeten schuiven om ze weer scherp te krijgen.

5. Het resultaat: Scherper dan ooit

Door deze methode te gebruiken, hebben de onderzoekers bewezen dat:

1. Ze urenlang kunnen fotograferen zonder dat de ankers verdwijnen.
2. Ze de "druif" (de beweging) zo goed kunnen corrigeren dat de foto's extreem scherp worden (binnen 2 nanometer, dat is 50.000 keer smaller dan een haar).
3. Ze dit zelfs kunnen toepassen op echte biologische monsters, zoals hartweefsel. Ze hebben laten zien dat ze de beweging van het hartweefsel kunnen corrigeren door de DNA-origami als "stabilisator" te gebruiken.

Conclusie

Dit artikel is als een handleiding voor het maken van de scherpste foto's ter wereld. De onderzoekers zeggen: "Als je heel lang wilt fotograferen met onze super-microscoop, gebruik dan deze DNA-origami als ankers. Dan weten we precies hoe de camera beweegt, en kunnen we de foto's later perfect scherpstellen."

Dit maakt het mogelijk om de kleinste details in levende cellen te zien, zonder dat de foto wazig wordt door trillingen of temperatuurveranderingen. Het is een grote stap voorwaarts in het begrijpen van hoe ons lichaam werkt, tot op het niveau van individuele moleculen.

Technische samenvatting

Probleemstelling

MINFLUX (MINimal FLuorescence photon FLUXes) is een tweede-generatie superresolutietechniek die fluorescente markers met nanometerprecisie in 3D kan lokaliseren. Een kritieke beperking bij langdurige MINFLUX-acquisities (vaak 6 tot 20 uur) is drift (verplaatsing van het beeld door temperatuurschommelingen of mechanische instabiliteit). Hoewel commerciële systemen beschikken over ingebouwde stabilisatie en driftcorrectie (zoals het MBM-systeem dat goudnanodeeltjes volgt), blijft er vaak nog residuale drift over. Deze resterende drift kan de uiteindelijke resolutie en precisie van de data aantasten.

Daarnaast kampt de veelgebruikte DNA-PAINT-methode (die vaak wordt gecombineerd met MINFLUX) met het probleem van site-verlies (site-loss): na verloop van tijd verdwijnen de docking-plekken voor de imager-oligonucleotiden, wat leidt tot onvolledige datasets bij lange acquisities. Traditionele korte docking-strands (8-10 nucleotiden) zijn hier gevoelig voor.

Methodologie

De auteurs hebben een geavanceerde kalibratie- en correctiemethode ontwikkeld met behulp van DNA-origami structuren:

1. DNA-Origami Templates: Ze gebruikten DNA-origami-structuren (ontwerp O1 en O2) met bekende ruimtelijke verdelingen van ankerpunten.
2. Repeat-Domain Docking Strands: In plaats van korte docking-strands, werden herhalende domeinen (repeat domains, specifiek de "10x RD P1" constructie) gebruikt. Deze lange, enkelstrengs DNA-sequenties zorgen voor meerdere bindingsmogelijkheden op één ankerpunt. Dit overwint het probleem van site-verlies en maakt het mogelijk om dezelfde locatie duizenden keren te bezoeken tijdens lange acquisities.
3. Driftcorrectie-algoritme:
   • Stap 1: Correctie met het bestaande MBM-systeem (Beamline Monitoring) dat drift volgt via goudnanodeeltjes.
   • Stap 2: Een nieuw algoritme voor gecorreleerde site-dispersie (correlated site-dispersion). Dit algoritme analyseert de tijd-gecorreleerde spreiding van localisaties rondom de bekende DNA-origami-punten. Door de systematische verplaatsing van clusters van localisaties in de tijd te analyseren, kan de resterende drift worden geschat en afgetrokken.
4. Biologische Toepassing: De methode werd getest op cryosecties van hartweefsel (ventrikels) met gelabelde Ryanodine-receptoren (RyR2). DNA-origami werd toegevoegd als referentiestructuur om drift te corrigeren tijdens het beeldvormen van de biologische targets.

Belangrijkste Bijdragen

• Validatie van Repeat-Domain DNA-PAINT: Het bewijzen dat lange repeat-domain strands (ca. 45 nt) geen meetbaar verlies aan localisatieprecisie veroorzaken ten opzichte van korte strands, dankzij snelle thermische fluctuaties die het effect van de "slingerende" DNA-keten middelen.
• Nieuwe Driftcorrectie: De introductie van een algoritme dat residuale drift schat op basis van de dispersie van localisaties rond bekende DNA-origami-punten, zelfs na toepassing van de standaard MBM-correctie.
• Kwaliteitsborging voor Biologische Samples: Demonstratie dat DNA-origami kan dienen als interne referentie in complexe biologische monsters om de kwaliteit van langdurige 3D MINFLUX-experimenten te garanderen.
• Isotrope 3D-resolutie: Het aantonen dat deze methode leidt tot een bijna isotrope precisie in alle drie de dimensies (x, y, z).

Resultaten

• Site-Precisie: Na toepassing van zowel MBM-correctie als de nieuwe residuale driftcorrectie, bedroeg de site-precisie (de spreiding van localisaties rond een punt) ongeveer 2 nm in alle richtingen.
• Driftreductie:
  • De MBM-correctie alone verlaagde de drift met een RMS (Root Mean Square) van 2,6 nm tot 6,1 nm (afhankelijk van de as).
  • De aanvullende correctie met het DNA-origami algoritme verlaagde de residuale drift verder naar een RMS van 1,0 nm tot 1,8 nm.
  • De totale driftrange (verschil tussen max en min) werd teruggebracht van ~28 nm naar ~10 nm in de x-richting.
• Resolutieverbetering: De correctie verbeterde de Fourier Ring Correlatie (FRC) van 11,6 nm naar 6,2 nm en de Fourier Shell Correlatie (FSC) naar 6,3 nm.
• Site-Verlies: Met standaard korte strands was er aanzienlijk site-verlies na enkele uren. Met de 10x RD repeat domains bleef het localisatiepercentage stabiel gedurende meer dan 8 uur, waardoor volledige DNA-origami-structuren en biologische patronen konden worden gereconstrueerd.
• Biologische Validatie: Bij het beeldvormen van RyR2 in hartweefsel bleek dat de driftcorrectie gebaseerd op de DNA-origami ook direct kon worden toegepast op de biologische markers zelf, mits deze voldoende vaak werden bezocht (herhaalde visits).

Significantie

Dit artikel biedt een cruciale oplossing voor een van de grootste uitdagingen in langdurige superresolutie-microscopie: het beheersen van drift op de nanometerschaal.

1. Betrouwbaarheid: Het stelt onderzoekers in staat om de prestaties van hun MINFLUX-instrumenten te kalibreren en te vergelijken, ongeacht de installatie.
2. Simpliciteit: Het gebruik van DNA-origami met repeat domains vereenvoudigt de sample-preparatie en acquisitieprotocollen, omdat het geen complexe chemische schakelbuffers nodig heeft en site-verlies elimineert.
3. Toekomstperspectief: De methode maakt "kwaliteitsgeborgde" (quality-assured) 3D MINFLUX-imaging van biologische structuren mogelijk, waarbij de theoretische limieten van de techniek (nanometerprecisie) praktisch haalbaar worden gemaakt over perioden van meerdere uren. Dit opent de deur voor het bestuderen van dynamische processen in cellen met ongekende resolutie.