High Resolution Multi-Pass Astral Analyzer Quantification Enables Highly Multiplexed 35-Plex Tandem Mass Tag Proteomics

Dit artikel beschrijft een nieuwe TMT HR-modus op het Orbitrap Astral Zoom-massaspectrometer die door middel van een multi-pass-beweging de resolutie aanzienlijk verhoogt, waardoor nauwkeurige 35-plex TMT-proteomische analyses mogelijk worden met een diepgang die vergelijkbaar is met de gouden standaard Orbitrap MS3-methode.

De kern

Stel je voor dat je een enorme bibliotheek hebt, gevuld met miljoenen boeken (eiwitten) uit een cel. Je wilt niet alleen weten welke boeken er zijn, maar ook precies hoeveel exemplaren van elk boek er in elke versie van de bibliotheek staan. Soms vergelijk je zelfs 35 verschillende bibliotheken tegelijkertijd.

Dit is wat wetenschappers doen in de proteomica (het bestuderen van eiwitten). Maar er zit een groot probleem: de boeken lijken op elkaar, en om ze te tellen, moet je ze heel snel en heel precies kunnen onderscheiden.

Hier is een eenvoudig verhaal over hoe dit nieuwe onderzoek dat probleem oplost, met behulp van een slimme truc.

1. Het Probleem: De "Verkeersfile" van de Bibliotheek

Stel je voor dat je boeken hebt die je hebt gemerkt met speciale stickers (de TMT-tags). Elke sticker heeft een andere kleur, maar ze zijn zo op elkaar afgestemd dat ze bijna onzichtbaar zijn voor het blote oog. Om ze te tellen, moet je ze in een machine gooien die ze in stukjes breekt en de stickers meet.

Bij de nieuwste, super-complexe methoden (35-plex) zijn de stickers zo op elkaar afgestemd dat ze slechts een harenbreedte van elkaar verwijderd zijn.

• Het oude probleem: De machines die we hadden, waren als een snelle auto die over een smalle weg rijdt. Ze konden niet snel genoeg stoppen om die harenbreedte te zien. Als je probeerde 35 verschillende kleuren tegelijk te meten, liepen ze in de war (zoals auto's in een file) en kon je de telling niet goed doen.

2. De Oplossing: De "Meerbaans" Truc

De wetenschappers hebben een nieuwe machine ontwikkeld (de Orbitrap Astral Zoom) en een slimme manier bedacht om hem te gebruiken. Ze noemen dit de "TMT HR mode".

Stel je voor dat de machine een racebaan is waar de deeltjes (de ionen) overheen rijden.

• Normale modus: De deeltjes rijden één keer rond de baan en worden gemeten. Dit is snel, maar niet precies genoeg voor die harenbreedte.
• De nieuwe truc (Multi-pass): De wetenschappers hebben een slimme poort (een "prisma") gebouwd die de deeltjes drie keer rond de baan laat rijden voordat ze worden gemeten.

De analogie:
Stel je voor dat je een lange weg moet afleggen om een klein detail te zien.

• Als je er één keer langs rijdt, zie je het detail misschien niet scherp.
• Als je er drie keer langs rijdt (in een langere lus), heb je veel meer tijd en ruimte om het detail scherp te stellen. Je kunt de stickers nu perfect van elkaar onderscheiden, zelfs als ze heel dicht bij elkaar zitten.

3. De Slimme Tweestaps-strategie

Er was één probleem met deze "drie ronden"-truc: als je te veel deeltjes tegelijk laat rennen, botsen ze en wordt het chaotisch (ruis). Ook kost het tijd.

De oplossing was een tweestapsplan:

1. Stap 1 (De Identificatie): De machine kijkt eerst snel naar de deeltjes om te zien welke boeken het zijn (peptiden identificeren). Dit gebeurt in de snelle, normale modus.
2. Stap 2 (De Telling): Vervolgens neemt de machine een tweede, speciale meting. Nu laat hij de deeltjes drie keer rondrennen (de lange lus) om alleen de stickers heel precies te tellen.

Het is alsof je eerst snel door een bibliotheek loopt om te zien welke boeken er zijn, en daarna langzaam en rustig naar de ruggen van de boeken kijkt om ze precies te tellen.

4. Waarom is dit geweldig?

• Meer precisie: Ze kunnen nu 35 verschillende monsters tegelijk vergelijken (35-plex), terwijl ze dat voorheen maar tot 18 konden.
• Diepere analyse: Ze kunnen veel meer eiwitten vinden in een monster dan ooit tevoren. Het is alsof ze ineens duizenden boeken meer kunnen vinden in hun bibliotheek.
• Snelheid: Ondanks dat ze twee metingen doen, is de machine zo snel dat het bijna net zo snel gaat als de oude methoden, maar dan met veel betere resultaten.

Samenvatting in één zin

De wetenschappers hebben een racebaan voor atomen verlengd door ze drie keer rond te laten rijden, zodat ze super-nauwkeurig kunnen tellen hoeveel er van 35 verschillende soorten eiwitten tegelijk aanwezig zijn, zonder dat ze in de war raken.

Dit betekent dat artsen en onderzoekers in de toekomst veel beter ziektes kunnen begrijpen en nieuwe medicijnen kunnen ontwikkelen, omdat ze de "taal" van de cellen veel duidelijker kunnen lezen.

Technische samenvatting

Titel: High Resolution Multi-Pass Astral Analyzer Quantification Enables Highly Multiplexed 35-Plex Tandem Mass Tag Proteomics

1. Het Probleem

Tandem Mass Tags (TMT) zijn een cruciaal hulpmiddel voor hoge doorvoer en nauwkeurige kwantificatie in de proteomica. De introductie van TMTpro reagentia met 35 plex (waarbij deuterium-gelabelde kanalen zijn toegevoegd) heeft de multiplexing verdubbeld van 18 naar 35. Dit creëert echter een groot analytisch probleem:

• De nieuwe reporter-ionen verschijnen als quadruplets met een zeer kleine massa-afstand van slechts 3 mDa bij een m/z van ongeveer 128.
• Om deze kanalen te onderscheiden en nauwkeurig te kwantificeren, is een resolutie van ongeveer 100.000 vereist.
• Bestaande massaspectrometers, zoals de standaard Orbitrap Astral, bereiken deze resolutie niet in hun normale bedrijfsmodus (vaak <50k-70k bij m/z 128), vooral niet onder invloed van ruimte-ladingseffecten bij hoge ionenintensiteiten.
• Traditionele multi-pass-modi (waarbij ionen extra rondjes maken in de analyzer) verhogen weliswaar de resolutie, maar verminderen het massa-bereik en maken gelijktijdige identificatie van peptiden en kwantificering van reporter-ionen onmogelijk, omdat de vluchttijden van lichte en zware ionen verwarren.

2. Methodologie

De auteurs hebben een nieuwe methode ontwikkeld voor de Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom massaspectrometer die de beperkingen van de multi-pass-modus omzeilt door een gesplitste acquisitiestrategie:

• TMT HR-modus (High Resolution): De Astral-analyzer wordt bediend in een multi-pass-modus (3 volledige passes), waardoor het ionenpad wordt verlengd van 30 m naar 90 m. Dit tripleert de resolutie voor een specifiek m/z-bereik.
• Gesplitste MS2-acquisitie: In plaats van te proberen zowel peptiden als reporter-ionen in één scan te meten, wordt de data-afhankelijke MS2-acquisitie opgesplitst in twee opeenvolgende stappen per precursor:
  1. Standaard MS2: Een snelle scan (max. 5 ms injectietijd) in single-pass-modus voor de identificatie van peptiden (fragmenten).
  2. TMT HR-scan: Een tweede scan (max. 50 ms injectietijd) in multi-pass-modus, uitsluitend gericht op de kwantificering van de TMT-reporter-ionen.
• Technische aanpassingen:
  • Om de focusvlakte van de ionenpakketten te corrigeren bij het schakelen tussen single- en multi-pass-modus (zonder de trage hoge-spanningsschakeling), wordt een laagspannings-compensatie-elektrode gebruikt.
  • De NCE (Normalized Collision Energy) wordt verhoogd (55%) in de HR-scan om de opbrengst van reporter-ionen te maximaliseren.
  • Een smalle isolatievenster (0,5 m/z) wordt gebruikt om interferentie te minimaliseren.
  • Een "Low Input"-modus met verhoogde detectorversterking werd getest om de signaal-ruisverhouding (S/N) te verbeteren bij lage ionenintensiteiten.

3. Belangrijkste Bijdragen

• Ontwikkeling van de TMT HR-modus: Een nieuwe operationele modus die de resolutie van de Astral-analyzer voldoende verhoogt om 3 mDa gescheiden reporter-ionen in 35-plex experimenten te onderscheiden.
• Hybride Acquisitiestrategie: Het oplossen van het conflict tussen identificatie en kwantificering door de scans te scheiden, waardoor de voordelen van hoge resolutie (voor kwantificering) en hoge snelheid (voor identificatie) gecombineerd worden.
• Validatie van 35-plex: Het aantonen dat 35-plex TMTpro-experimenten haalbaar zijn op een Orbitrap Astral-platform, wat voorheen als onmogelijk werd beschouwd vanwege de resolutie-eisen.

4. Resultaten

• Resolutie en Kwantificering: De methode slaagde erin reporter-ionenquadruplets (3 mDa afstand) consistent te deconvolueren en nauwkeurig te kwantificeren, zelfs bij hoge ionenintensiteiten (tot 500-1000 ionen per multiplet).
• Diepte van Analyse (HeLa 32-plex):
  • In de standaard single-pass modus stortte het aantal gequantificeerde eiwitten in bij een 32-plex HeLa-staal (van >4500 naar slechts 10) vanwege niet-opgeloste pieken.
  • Met de TMT HR-modus werden >4500 eiwitgroepen gequantificeerd, met nauwkeurige herproductie van 1:4 concentratieverhoudingen.
• Vergelijking met Goudstandaard (2-Cell Line 35-plex):
  • De TMT HR-modus leverde 2320 gequantificeerde eiwitten op in een 90-minuten run.
  • De "goudstandaard" Orbitrap Eclipse met RTS-SPS-MS3 methode leverde slechts 1330 eiwitten op.
  • Hoewel de MS3-methode bekend staat om het verminderen van chemische interferentie, toonde de PCA-analyse (Principle Component Analysis) aan dat de kwantitatieve precisie van de TMT HR-modus vergelijkbaar is met de MS3-methode.
  • De TMT HR-modus vertoonde minder variatie door deuterium-effecten (retentie-tijd verschuivingen) dan de MS3-methode, waarschijnlijk door de hogere snelheid van de Astral-analyzer.
• Low Input Modus: Het activeren van de Low Input-modus verhoogde de mediane S/N-ratio van <50 naar >130 en verdubbelde het aantal gequantificeerde eiwitgroepen (van 1750 naar 2750) in een gevoeligheidsbeperkte setup.

5. Betekenis en Conclusie

Deze studie toont aan dat het gebruik van multi-pass operatie in de Astral-analyzer, gekoppeld aan een slimme gesplitste acquisitiestrategie, de barrière voor 35-plex TMT-proteomica doorbreekt.

• Doorbraak: Het maakt hoge multiplexing (35-plex) mogelijk zonder in te leveren op de analytische diepte, wat eerder alleen mogelijk was met langzamere Orbitrap-only methoden of MS3-technieken.
• Efficiëntie: De methode biedt een aanzienlijke toename in experimentele doorvoer en diepte van analyse vergeleken met state-of-the-art Orbitrap-only methoden.
• Toekomstperspectief: De techniek is veelbelovend voor toepassingen met lage input, zoals single-cell proteomica, waar het combineren van hoge multiplexing met de hoge gevoeligheid van de Astral-analyzer essentieel is.

Kortom, de "TMT HR mode" transformeert de Orbitrap Astral Zoom tot een krachtig instrument voor ultra-hoge multiplexing proteomica, waarbij de snelheid van de Astral-analyzer wordt gecombineerd met de resolutie die nodig is voor de nieuwste generatie TMT-reagentia.