Combinatorial optimization of protein systems in synthetic cells

Dit artikel beschrijft een combinatorische optimalisatiestrategie voor eiwitsystemen in synthetische cellen, waarbij grote populaties van DNA-varianten worden gescreend om de interacties tussen meerdere genen te onthullen en de functionele prestaties van complexe modules zoals DNA-replicatoren en fosfolipidesynthesewegen te verbeteren.

De kern

Titel: Het bouwen van een perfecte fabriek in een zeepbel: Hoe wetenschappers kunstmatige cellen optimaliseren

Stel je voor dat je een mini-fabriek wilt bouwen, maar dan niet van bakstenen en staal, maar van eiwitten en DNA. En je wilt deze fabriek niet in een gebouw, maar in een kleine, drijvende zeepbel (een liposoom). Dit is wat wetenschappers doen bij het creëren van synthetische cellen. Het doel is om deze cellen taken te laten uitvoeren, zoals het maken van medicijnen of het kopiëren van DNA.

Maar hier is het probleem: als je zo'n fabriek bouwt, werkt hij vaak niet perfect. De machines (eiwitten) werken niet samen, of er zijn er te veel van de ene en te weinig van de andere. In de natuur duurt het miljoenen jaren om dit door evolutie te verbeteren. Deze wetenschappers wilden dat proces versnellen en hebben een slimme manier bedacht om het in een dag of twee te doen.

Hier is hoe ze het deden, vertaald in begrijpelijke taal:

1. De Grote Loterij (Combinatorische Bibliotheken)

Stel je voor dat je een recept hebt voor een taart, maar je weet niet precies hoeveel suiker, bloem en eieren je moet gebruiken. In plaats van één taart te bakken en te proeven, bak je duizenden taarten tegelijk, waarbij je bij elke taart net even andere hoeveelheden gebruikt.

De wetenschappers maakten een enorme "loterij" van DNA-varianten. Ze veranderden kleine stukjes van het DNA (de instructies voor de machines) op duizenden manieren.

• Doel 1: Ze maakten een fabriek die DNA kopieert (een DNA-replicator).
• Doel 2: Ze maakten een fabriek die vetten maakt (fosfolipiden), de bouwstenen van celmembranen.

Ze veranderden vooral de "startknoppen" van de instructies (RBS's). Dit bepaalt hoe snel de fabriek een machine gaat bouwen. Soms maakten ze de knop harder (sneller bouwen), soms zachter (langzamer bouwen).

2. De Grote Keuze (Selectie)

Nu hadden ze een enorme bak met zeepbellen, elk met een iets andere versie van hun fabriek. Hoe vinden ze de beste?

• Voor de DNA-fabriek: Ze lieten de zeepbellen gewoon werken. Als een zeepbel zijn eigen DNA goed kon kopiëren, werd die zeepbel "rijker" aan DNA. Na een tijdje keken ze welke zeepbellen de meeste DNA-kopieën hadden. Die waren de winnaars! Dit noemen ze zelf-selectie.
• Voor de vet-fabriek: Ze hadden een slimme truc nodig. Ze voegden een fluorescerende (lichtgevende) marker toe. Als de fabriek goed werkte en veel vetten maakte, ging de zeepbel fel rood oplichten. Ze gebruikten een super-snelle camera (een sorteermachine) die alle lichtgevende zeepbellen eruit haalde en de donkere weggooide. Dit noemen ze FACS-sorteer.

3. De Analyse: Wat werkt het beste?

Na het selecteren van de winnaars, keken ze precies naar het DNA van die winnende zeepbellen. Ze ontdekten interessante dingen:

• Bij de DNA-fabriek: Het bleek heel voorspelbaar. Als je de startknoppen van de machines iets harder zette, werkte de fabriek beter. Het was alsof je de motor van een auto een beetje harder draaide en hij gewoon sneller reed. De verschillende machines werkten goed samen zonder elkaar te storen.
• Bij de vet-fabriek: Dit was veel lastiger. Hier werkte "harder werken" niet altijd beter. Soms moest je de ene machine juist langzamer laten draaien zodat de andere machine niet overbelast raakte. Het was alsof je een orkest hebt: als de trompettist te hard blaast, klinkt het niet mooi, tenzij de drummer ook even harder slaat. De wetenschappers zagen dat de machines elkaar beïnvloedden op complexe manieren (dit noemen ze epistase).

4. De Leerervaring: Voorspellen en Verbeteren

De wetenschappers probeerden te voorspellen welke combinatie het beste zou werken door de resultaten van de losse veranderingen te combineren.

• Bij de simpele DNA-fabriek was hun voorspelling perfect.
• Bij de complexe vet-fabriek was hun voorspelling minder goed. Dit betekent dat bij complexe systemen de hele "recept" samen moet worden getest, omdat je niet kunt weten wat er gebeurt door alleen de losse ingrediënten te bekijken.

Waarom is dit belangrijk?

Dit onderzoek is een enorme stap vooruit in het bouwen van kunstmatige levensvormen.
Stel je voor dat je in de toekomst een synthetische cel wilt bouwen die ziektes geneest of plastic uit de oceaan eet. Je kunt niet zomaar één gen aanpassen en hopen dat het werkt. Je moet het hele systeem optimaliseren.

Deze studie laat zien dat je:

1. Duizenden varianten tegelijk kunt testen in kleine zeepbellen.
2. De winnaars kunt selecteren met slimme methoden.
3. Leert dat complexe systemen (zoals een hele cel) moeilijker te voorspellen zijn dan simpele systemen, en dat je daarom "slimme loterijen" moet gebruiken in plaats van alleen maar losse onderdelen te testen.

Kortom: Ze hebben een manier gevonden om in een laboratorium, in een paar dagen, te doen wat de natuur in miljoenen jaren doet: het vinden van de perfecte balans tussen alle onderdelen van een levend systeem. Dit is de sleutel tot het bouwen van echte kunstmatige cellen in de toekomst.

Technische samenvatting

Probleemstelling

De in vitro reconstitutie van complexe eiwitsystemen (zoals metabole routes, genetische circuits of biosensoren) in synthetische cellen vereist vaak optimalisatie om hun functionele prestaties te verbeteren. Hoewel het optimaliseren van individuele genen (bijvoorbeeld via promoter- of RBS-engineering) een routineprocedure is, vormt de multivariate optimalisatie van systemen met meerdere eiwitten een grote uitdaging.
De kernproblemen zijn:

1. Combinatorische explosie: Het aantal mogelijke varianten bij het muteren van meerdere genen tegelijkertijd is enorm.
2. Epistatische effecten: De interactie tussen mutaties in verschillende genen is vaak onvoorspelbaar. Veranderingen in de expressie van het ene eiwit kunnen de expressie van andere eiwitten beïnvloeden door concurrentie om beperkte resources (zoals tRNA's, aminozuren en ribosomen) in het celvrije systeem.
3. Ontbrekende kennis: Het is onduidelijk hoe het veranderen van translatiesnelheden van meerdere genen tegelijkertijd het totale expressiepatroon en de functionaliteit van het systeem beïnvloedt in een in vitro omgeving (PURE-systeem).

Methodologie

De auteurs hebben een geïntegreerde aanpak ontwikkeld om combinatorische DNA-bibliotheken te screenen in liposomen (synthetische cellen) die het PURE-systeem (Protein synthesis Using Recombinant Elements) bevatten.

1. Ontwerp van Combinatorische Bibliotheken:
Er werden twee genetische modules onderzocht:

• DNA-replicator: Een systeem gebaseerd op bacteriofaag Phi29, bestaande uit twee eiwitten: DNA-polymerase (DNAP) en terminaal eiwit (TP).
• Fosfolipide-syntheseweg: Een route van vier enzymen (PlsB, PlsC, CdsA, PssA) uit E. coli die fosfatidylserine (PS) produceert.

Voor beide systemen werden twee strategieën gebruikt om de translatiesnelheid te variëren:

• RBS-varianten: Het creëren van een bibliotheek met variërende Ribosome Binding Sites (RBS) voor elk gen, wat leidt tot verschillende voorspelde translatie-initiatiesnelheden (TIR).
• GC-content mutaties: Het silent muteren van de eerste zes codons (voornamelijk de derde base) om de GC-content te variëren, wat de vorming van mRNA-secundaire structuren beïnvloedt en daarmee de translatie.

2. Genereer- en Selectieprotocollen:

• Bibliotheekgeneratie: De bibliotheken werden gegenereerd met de MOSAIC-methode (Multiplex One-Step Single-Stranded DNA Annealing Protein-mediated plasmid diversification) in E. coli.
• In-liposoom expressie: DNA-varianten werden ingekapseld in liposomen met een gemiddelde kopie-aantal van 1 (of 0,2) per liposoom, zodat elke liposoom functioneel als een individuele synthetische cel kon worden beschouwd.
• Selectie/Screening:
  • Voor DNA-replicatie: Genotype-phenotype koppeling via zelf-selectie. Liposomen met succesvolle replicatie produceerden meer DNA, wat leidde tot een verhoogde frequentie van die varianten na PCR-verrijking.
  • Voor fosfolipiden: FACS-screening. De productie van PS werd gemeten via een fluorescente reporter (LactC2-mCherry). Liposomen met de hoogste fluorescentie werden gesorteerd via Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

3. Analyse:

• Lang-lees sequencing (Nanopore): Om de volledige combinatorische varianten (met mutaties op meerdere loci) te identificeren zonder ze te hoeven barcoderen.
• Validatie: Klonale varianten werden geselecteerd en getest via qPCR, confocale microsopie en SDS-PAGE (met GreenLys-labeling) om eiwitniveaus en productievolumes te kwantificeren.
• Voorspellingsmodellen: De fitness van combinatorische varianten werd vergeleken met de som van de effecten van individuele mutaties om epistase te detecteren.

Belangrijkste Resultaten

1. DNA-replicatie Systeem (2 genen):

• De selectie leidde tot een verrijking van varianten met sterke RBS's voor zowel TP als DNAP.
• De fitness (verrijking) was sterk afhankelijk van de voorspelde TIR van TP, maar minder van DNAP.
• Voorspelbaarheid: Er was een zeer sterke correlatie ($R^2 = 0,94$) tussen de waargenomen fitness van combinatorische varianten en de voorspelde fitness gebaseerd op individuele mutaties. Dit suggereert dat er weinig epistatische interacties zijn in dit twee-gensysteem; de effecten van mutaties zijn grotendeels additief/multiplicatief.

2. Fosfolipide-synthese Systeem (4 genen):

• Screening via FACS resulteerde in een verrijking van varianten met sterke RBS's voor PlsB, CdsA en PssA.
• PlsC is minder kritisch: In tegenstelling tot de andere enzymen, toonde PlsC een brede spreiding aan RBS-strengths onder de beste presteerders. Dit komt doordat de conversie van het intermediaire product (PA) door CdsA de flux beperkt; de PS-productie is dus minder gevoelig voor de hoeveelheid PlsC.
• Voorspelbaarheid: De correlatie tussen voorspelde en waargenomen fitness was aanzienlijk lager ($R^2 = 0,38$ voor RBS-bibliotheek) dan bij het DNA-replicatorsysteem. Dit wijst op sterke epistatische effecten en complexe interacties in het grotere netwerk.
• Eiwitexpressie: Het verhogen van de RBS-strength van alle enzymen tegelijk leidde niet noodzakelijk tot meer eiwitproductie. In sommige gevallen leidde het verlagen van de expressie van één eiwit tot een compenserende toename van andere eiwitten, wat suggereert dat resources (zoals tRNA's) beperkend zijn.

3. Effect van GC-content:

• Mutaties in de eerste codons (GC-content) hadden specifieke effecten. Een G op de derde positie van de tweede codon bleek overal negatief te zijn voor de expressie.
• De impact van mutaties was het grootst voor plsB en pssA, en het kleinst voor plsC, wat consistent is met de RBS-screening.

Belangrijkste Bijdragen

1. Schaalvergroting in synthetische biologie: Het artikel toont aan dat combinatorische optimalisatie succesvol kan worden uitgebreid van single-gene naar multi-proteïne systemen in synthetische cellen.
2. Validatie van voorspelbaarheid: Het demonstreert dat de voorspelbaarheid van combinatorische mutaties afhangt van de complexiteit van het systeem. Twee-gensystemen zijn goed voorspelbaar, terwijl vier-gensystemen (met metabole fluxen) onvoorspelbaarder zijn door epistase.
3. Nieuwe selectiemethoden: Het koppelen van DNA-zelfreplicatie aan selectie en het gebruik van FACS voor metabole routes in liposomen biedt robuuste methoden voor directed evolution in celvrije systemen.
4. Inzicht in resource-concurrentie: De resultaten tonen aan dat in het PURE-systeem de expressie van meerdere genen niet onafhankelijk is; mutaties in het ene gen kunnen de expressie van andere genen beïnvloeden door concurrentie om translatieressources.

Significantie en Toekomstperspectief

De studie levert een fundamenteel inzicht in hoe complexe genetische netwerken in synthetische cellen kunnen worden geoptimaliseerd. Het bewijst dat "kleine maar slimme" bibliotheken, gecombineerd met high-throughput screening en long-read sequencing, effectief zijn om de fitness-landschappen van synthetische systemen te verkennen.

De bevindingen zijn cruciaal voor de toekomstige ontwikkeling van volledig functionele kunstmatige cellen. Om grotere genetische en metabole netwerken te engineeren, moeten onderzoekers rekening houden met epistatische effecten en resource-concurrentie. De auteurs suggereren dat toekomstige benaderingen moeten evolueren van het testen van individuele mutaties naar het gebruik van machine learning (active learning) en geavanceerde screeningstechnieken (zoals microscopie-gebaseerde sortering) om de enorme zoekruimte van combinatorische DNA-varianten efficiënt te navigeren. Dit is een noodzakelijke stap richting het bouwen van levensvatbare, zelfreplicerende synthetische cellen.