Investigation of sterile hydrogels as topical vehicles for APOSEC™, a stressed peripheral blood mononuclear cell secretome for the treatment of poorly healing wounds

Deze studie toont aan dat een gesteriliseerde hydrogel (APOgel) voor de toediening van APOSEC™ een verbeterde afgifte van werkzame stoffen mogelijk maakt, maar dat de huidige injectiespuit-mixmethode voor een uniforme verdeling van het geneesmiddel nog geoptimaliseerd moet worden, terwijl de uiteindelijke formulering wel effectief blijft bij de genezing van wonden.

De kern

Het Verhaal: Een Nieuwe Manier om Wonden te Genezen

Stel je voor dat je een oude, hardnekkige wond hebt die niet wil genezen, zoals bij ernstige diabetes. Artsen gebruiken nu een speciale "super-kruidenmix" genaamd APOSEC. Dit is geen gewone zalf, maar een vloeibare mix van eiwitten en kleine deeltjes die uit menselijke bloedcellen komen. Deze mix helpt het lichaam om nieuwe huid te maken.

Maar er is een probleem: deze vloeibare mix moet direct op de wond. Als je het alleen maar als water op een wond plakt, loopt het er zo af. Daarom wordt het gemengd met een gel (een soort dikke, plakkerige zalf) om het vast te houden.

In dit onderzoek wilden de wetenschappers twee dingen verbeteren:

1. Makkelijker maken: Nu moet het ziekenhuispersoneel de gel en de vloeistof handmatig in een spuit doen en schudden. Dat is lastig en kan onhygiënisch zijn.
2. Beter bewaren: Ze wilden een gel maken die al in de spuit zit en die steriel (vrij van bacteriën) is gemaakt door het te koken (autoclaveren), zodat het direct klaar is voor gebruik.

---

De Vergelijking: De Gel als een "Wolkenkrabber" en de Vloeistof als "Verkeersdrukte"

1. Het Maken van de Gel (APOgel)

De onderzoekers maakten een nieuwe gel, de APOgel. Ze wilden dat deze net zo dik en plakkerig was als de huidige standaardgel (Nu-Gel), zodat het makkelijk op de wond te smeren is.

• Het Probleem: Om de gel steriel te maken, moeten ze hem verhitten (zoals in een pressure cooker). Helaas maakt hitte sommige gels dunner, alsof je boter smelt.
• De Oplossing: Ze voegden meer van een speciaal ingrediënt toe (HEC) aan de gel voordat ze hem verhitten.
• De Analogie: Stel je voor dat je een dikke soep maakt. Als je die opwarmt, wordt hij dunner. Dus, voordat je hem opwarmt, voeg je extra bloem toe. Na het opwarmen is de soep weer precies de juiste dikte. Zo maakten ze de APOgel: dik genoeg om te blijven zitten, maar niet te dik om te smeren.

2. Het Schudden in de Spuit (De "Mix")

Nu komt het lastige deel. De arts moet de vloeibare "super-kruidenmix" (APOSEC) toevoegen aan de gel in de spuit en alles goed schudden door het heen en weer te pompen tussen twee spuiten.

• De Verrassing: Ze dachten dat alles perfect zou mengen, maar dat was niet zo.
• De Analogie: Stel je voor dat je een grote fles met honing en een beetje siroop mengt. Als je de fles schudt, lijkt het gemengd. Maar als je nu drie lepels uit de fles haalt, zit er in de eerste lepel meer siroop dan in de tweede, en weer meer in de derde.
• Wat ze zagen: De eerste en de laatste dosis die uit de spuit kwam, hadden iets meer van de genezende stoffen dan de doses in het midden. Het mengsel was niet 100% gelijkmatig verdeeld. Dit is een belangrijk punt: als je een wond behandelt, wil je dat elke druppel evenveel werk doet.

3. Hoe werkt het in het lichaam? (De "Spons")

Ze keken ook hoe snel de genezende stoffen uit de gel vrijkwamen.

• De Verrassing: De nieuwe APOgel gaf de genezende stoffen sneller af dan de oude gel.
• De Analogie: De oude gel was als een strakke, dichte spons die de stoffen langzaam losliet. De nieuwe, gesteriliseerde gel was als een iets losser geweven spons. Hij liet de stoffen sneller vrij, maar hij zwol ook meer op (nam meer vocht op), wat goed is voor een natte wond.

4. De Echte Test (Muizen)

Uiteindelijk testten ze het op muizen met wonden.

• Het Resultaat: Ondanks dat de nieuwe gel de stoffen sneller afgeeft en het mengsel niet perfect gelijkmatig was, werkte het net zo goed als de oude gel.
• De Les: Soms is de theorie (hoe snel iets vrijkomt in een lab) anders dan de praktijk (hoe het werkt in een levend lichaam). De muizen genezen even snel, ongeacht of ze de oude of de nieuwe gel kregen.

---

Conclusie: Wat betekent dit voor ons?

Dit onderzoek is een grote stap voorwaarts voor de toekomst van wondzorg:

1. Makkelijker voor artsen: Ze kunnen een steriele spuit met gel kopen die ze niet zelf hoeven te vullen. Dat bespaart tijd en vermindert het risico op infecties.
2. Beter voor de patiënt: De nieuwe gel werkt net zo goed als de oude, maar is makkelijker te gebruiken.
3. Een klein puntje van aandacht: Het schudden van de spuit moet misschien nog net iets beter worden uitgezocht, zodat elke dosis precies evenveel werkstoffen bevat. Maar zelfs met dit kleine gebrek, is het een winnaar.

Kort samengevat: De wetenschappers hebben een nieuwe, "kookbestendige" gel ontwikkeld die als een trouwe helper fungeert voor een krachtige genezingsmix. Het is niet perfect (het mengen kan nog beter), maar het werkt uitstekend en maakt het leven van artsen en patiënten een stuk makkelijker.

Technische samenvatting

Titel: Onderzoek naar steriele hydrogels als topische dragers voor APOSECTM voor de behandeling van slecht helende wonden

1. Het Probleem

Chronische, niet-helende wonden (zoals diabetische voetzweren) vormen een ernstig medisch probleem met een hoog risico op amputatie en sterfte. Een veelbelovende therapie is APOSECTM, een celvrij secretoom (een mengsel van eiwitten, lipiden en extracellulaire vesikels) afkomstig van gestresste perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's).
Huidige klinische toepassingen vereisen dat het lyofilisaat van APOSECTM handmatig wordt gereconstitueerd en gemengd met een bestaande steriele gel (Nu-Gel) in de ziekenhuisapotheek. Dit proces heeft twee belangrijke beperkingen:

1. Het vereist handmatig vullen en mengen, wat de voorbereidingstijd verlengt en het risico op microbiële contaminatie vergroot.
2. Het huidige systeem is beperkt tot een enkele dosis, wat flexibiliteit voor verschillende wondgroottes beperkt.

Er is behoefte aan een geoptimaliseerd systeem dat een vooraf gevulde, steriele gel biedt die via een gesloten systeem met de vloeibare APOSECTM kan worden gemengd, met als doel een uniforme verdeling van het actieve ingrediënt en een verbeterde toediening.

2. Methodologie

De onderzoekers ontwikkelden en testten een nieuw systeem, genaamd APOSEC 2.0, bestaande uit een nieuwe hydrogel (APOgel) en een injectiespuit-mengsysteem.

• Ontwikkeling van APOgel:

  • Een nieuwe gelformulatie werd ontwikkeld op basis van de bestaande Nu-Gel, maar aangepast om terminale sterilisatie (autoclaven: 121°C, 2 bar, 15 min) in vooraf gevulde COP-spuiten (cyclo-olefin polymeer) te kunnen doorstaan.
  • Om de viscositeitsdaling door hitte te compenseren, werd het gehalte aan hydroxyethylcellulose (HEC) verhoogd van 0,1% naar 2,0% (w/w).
  • De gel werd geproduceerd onder GMP-omstandigheden en vervolgens gesteriliseerd.

• Mengkarakterisering:

  • Een spuit-tot-spuit mengprocedure werd getest: 1 mL gereconstitueerde vloeistof (als surrogaat voor APOSECTM werd AM2-medium gebruikt) werd gemengd met 3 g APOgel door de inhoud 20 keer heen en weer te pompen tussen twee spuiten via een Luer-connector.
  • Rheologie: Viscositeit werd gemeten bij verschillende schuifsnelheden.
  • Uniformiteit: De verdeling van actieve stoffen (gemeten via fluoresceïne en totale eiwitten) werd geanalyseerd in drie opeenvolgende doses uit dezelfde spuit om menguniformiteit te beoordelen.
  • Steriliteit en Stabiliteit: Tests omvatten sterilitie (groei van Bacillus subtilis en Aspergillus brasiliensis), pH-metingen, ATR-FTIR spectroscopie (op afbraakproducten) en visuele inspectie.

• In vitro en In vivo Evaluatie:

  • In vitro: Vrijgavekinetiek van kleine moleculen en eiwitten werd gemeten in Franz-diffusiecellen over 6 uur en 72 uur.
  • In vivo: Een muismodel (Balb/C) met full-thickness excisie-wonden werd gebruikt om de helingsefficiëntie te vergelijken tussen APOgel en de benchmark Nu-Gel, beide gemengd met APOSECTM.

3. Belangrijkste Bijdragen

• Ontwikkeling van een autoclaveerbare gel: De eerste formulering van een topische gel die specifiek is ontworpen om terminale sterilisatie in een vooraf gevulde spuit te doorstaan zonder significante degradatie van de werkzame bestanddelen.
• Karakterisering van een gesloten mengsysteem: Een grondige analyse van de uitdagingen bij het mengen van een viskeuze gel met een vloeistof in een gesloten systeem, met specifieke aandacht voor de homogeniteit van de dosis.
• Koppeling van in vitro vrijgave aan in vivo effectiviteit: Het inzicht dat verschillen in vrijgavekinetiek (in vitro) niet noodzakelijk leiden tot verschillen in therapeutische uitkomst (in vivo) bij dit type toediening.

4. Resultaten

• Fysisch-Kenmerken: De gesteriliseerde APOgel behield een viscositeit die vergelijkbaar was met de benchmark Nu-Gel (~325-350 Pa·s bij 1 s⁻¹), hoewel er een lichte daling werd waargenomen na sterilisatie. Er werden geen chemische afbraakproducten gedetecteerd via FTIR en de pH bleef stabiel.
• Menguniformiteit (Kritieke Bevinding): Het mengen van de vloeistof en gel in de spuit resulteerde in een niet-homogene verdeling van het actieve ingrediënt. De eerste en laatste doses uit de spuit bevatten ongeveer 20% meer actief ingrediënt dan de middelste dosis. Dit duidt op een concentratiegradiënt binnen de gesloten spuit.
• Vrijgavekinetiek: De APOgel-mengsels toonden een snellere en uitgebreidere vrijgave van zowel kleine moleculen als totale eiwitten in vergelijking met de benchmark Nu-Gel. Dit werd toegeschreven aan de lagere viscositeit en een sterkere zwelling van de APOgel, wat mogelijk gunstig is voor het opnemen van wondvocht.
• In vivo Effectiviteit: Ondanks de verschillen in vrijgavekinetiek en viscositeit, toonde het muismodel geen significant verschil in wondhelingskinetiek tussen de APOgel- en Nu-Gel-groepen. Beide groepen vertoonden vergelijkbare genezingssnelheden.

5. Betekenis en Conclusie

De studie concludeert dat APOgel een levensvatbaar, steriel platform is voor de topische toediening van biologische producten zoals APOSECTM. Het biedt voordelen zoals een vooraf gevulde, steriele vorm die de voorbereidingstijd verkort en het contaminatierisico verlaagt.

Echter, de studie benadrukt een belangrijke beperking: het huidige spuit-mengsysteem zorgt niet voor een uniforme verdeling van het medicijn over de hele dosis. Voor een betrouwbare dosering is verdere optimalisatie van het mengapparaat of de mengprocedure noodzakelijk.

Hoewel de APOgel sneller werkzame stoffen vrijmaakt dan de benchmark, bleek dit in de dierproef niet te leiden tot een superieure genezing, wat suggereert dat de in vitro vrijgaveprofielen niet altijd de in vivo situatie volledig weerspiegelen. Het onderzoek biedt waardevolle inzichten voor de ontwikkeling van toekomstige dragers voor extracellulaire vesikels (EV's) en andere biologische therapieën.